[학위논문]MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 새로운 생-분석 방법 : 초고민감도 항원 감지, 바이오칩의 단백질 절대 정량과 소분자 분석 MALDI-TOF MS as a New Bio-analytical Tool : Applications to Ultra Sensitive Antigen Detection, Absolute Quantitation of Proteins on Biochips and Analysis of Small Molecules원문보기
현재 생기능성 표면은 생화학/생물학 연구 응용 분야에서 널리 이용되고 있다. 바이오칩과 바이오(나노)물질들과 같은 다양한 생표면에서 광범위한 생화학/생물학 현상들을 정확하고 신빙성 있게 검출할 수 있다. MALDI-TOF 질량 분석기는 생물학적 오염물질들의 비교적 높은 내성, 간단한 준비 과정, 무엇보다도 표지 없이 분석할 수 있도록 분석물의 분자량을 제공해 주기 때문에 새로운 생물 분석의 도구로써 효과적이다. 이 논문에서는 생분석 방법으로 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 세 가지 응용을 소개하였다. 첫 번째 주제에서는 금 표면을 이용한 자기조립단분자층 (SAMs)과 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 새로운 비표지, 신호증폭 분석에 대한 연구이다. 금 표면이 갖는 특이적 반응성을 이용하여 2 ...
현재 생기능성 표면은 생화학/생물학 연구 응용 분야에서 널리 이용되고 있다. 바이오칩과 바이오(나노)물질들과 같은 다양한 생표면에서 광범위한 생화학/생물학 현상들을 정확하고 신빙성 있게 검출할 수 있다. MALDI-TOF 질량 분석기는 생물학적 오염물질들의 비교적 높은 내성, 간단한 준비 과정, 무엇보다도 표지 없이 분석할 수 있도록 분석물의 분자량을 제공해 주기 때문에 새로운 생물 분석의 도구로써 효과적이다. 이 논문에서는 생분석 방법으로 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 세 가지 응용을 소개하였다. 첫 번째 주제에서는 금 표면을 이용한 자기조립단분자층 (SAMs)과 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 새로운 비표지, 신호증폭 분석에 대한 연구이다. 금 표면이 갖는 특이적 반응성을 이용하여 2 마이크로 미터 크기의 금 입자의 표면에 5%는 항체를 고정시키고 95%는 oligo(ethylene glycol)로 고정시켰다. 그리고 이와 다른 항체는 oligo(ethylene glycol)로 코팅한 바이오칩에 고정시켰다. 용액 상에 존재하는 검출하고자 하는 단백질(항원)은 이와 특이적 결합을 하는 항체가 고정 되어있는 금 입자와 바이오칩 사이에 sandwich assay와 같은 방법으로 분석하였다. 항원의 존재는 금 입자 표면에 있는 oligo(ethylene glycol)의 MALDI-TOF 질량 분석기를 통한 간접적인 신호에 의해 입증되었다. 이처럼 표면에 수식된 유기분자를 Am-Tag라고 한다. 비만 관련 질환과 관련된 adiponectin과 간 질환과 관련된 단백질인 AFP, 이 두 단백질을 가지고 실험을 하였다. 이 방법을 통하여 1~10 aM (아토몰, 10-18 M)의 항원을 초고감도 분석을 증명하였고, 이는 알려진 검출 방법 중에 가장 민감하다고 생각된다. 둘째, 리간드가 수식된 바이오칩에 특이적 결합을 하는 표적 단백질을 정량하기 위해 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하였다. 이 단백질은 트립신(단백질분해효소)에 의해 분해되고 그 결과물인 펩타이드는 동위원소가 있는 내위표준물질과 같이 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석한다. 내위표준물질은 분해된 표적 단백질의 대표하는 펩타이드와 같은 서열을 같지만 다른 분자량을 갖는다. 바이오칩에 특이적으로 결합된 단백질의 절대적인 양은 대표적인 펩타이드와 내위표준물질과의 질량분석기의 질량 세기의 비교로써 정량할 수 있다. 이 두 분석물의 질량 측정 세기는 같은 분자 환경을 갖고 있기 때문에 칩에서의 분석물의 실제 양을 나타낸다. 바이오칩에 고정시킨 GSH(리간드)와 특이적 결합을 하는 GST와 GST가 섞인 단백질을 가지고 실험하였다. 이는 재현성 있게 리간드의 비중에 따라 단백질의 절대 정량을 보여주었다. 진동 수정 마이크로저울 (QCM), 브래드포드 방법, BCA 방법과 같은 현재의 표면-단백질 정량 방법에서 이 방법이 새로운 흥미로운 방법으로 보여줄 수 있을 것이라 생각된다. 마지막으로, 우리는 유기 매트릭스 없이 골드마이크로 입자를 사용하여 낮은 분자량의 물질들을 분석하였다. 아미노산, 당류, 펩타이드 그리고 이 소분자의 혼합물을 실험하였다. 이 질량 분석기를 이용한 분석은 피크 주변의 어떤 영향 없이 분석물의 이온 피크 만이 나타나는 것을 보여준다. 게다가, thiol이 존재하는 분자들을 혼합된 시료 안에서 금 마이크로 입자와의 특이적 결합을 이용하여 선택적으로 분리하고 분석할 수 있다. 이런 방법은 유기 매트릭스보다 간편하고, 민감도와 선택적 감도가 좋고 재현성이 있다고 생각된다.
현재 생기능성 표면은 생화학/생물학 연구 응용 분야에서 널리 이용되고 있다. 바이오칩과 바이오(나노)물질들과 같은 다양한 생표면에서 광범위한 생화학/생물학 현상들을 정확하고 신빙성 있게 검출할 수 있다. MALDI-TOF 질량 분석기는 생물학적 오염물질들의 비교적 높은 내성, 간단한 준비 과정, 무엇보다도 표지 없이 분석할 수 있도록 분석물의 분자량을 제공해 주기 때문에 새로운 생물 분석의 도구로써 효과적이다. 이 논문에서는 생분석 방법으로 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 세 가지 응용을 소개하였다. 첫 번째 주제에서는 금 표면을 이용한 자기조립단분자층 (SAMs)과 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 새로운 비표지, 신호증폭 분석에 대한 연구이다. 금 표면이 갖는 특이적 반응성을 이용하여 2 마이크로 미터 크기의 금 입자의 표면에 5%는 항체를 고정시키고 95%는 oligo(ethylene glycol)로 고정시켰다. 그리고 이와 다른 항체는 oligo(ethylene glycol)로 코팅한 바이오칩에 고정시켰다. 용액 상에 존재하는 검출하고자 하는 단백질(항원)은 이와 특이적 결합을 하는 항체가 고정 되어있는 금 입자와 바이오칩 사이에 sandwich assay와 같은 방법으로 분석하였다. 항원의 존재는 금 입자 표면에 있는 oligo(ethylene glycol)의 MALDI-TOF 질량 분석기를 통한 간접적인 신호에 의해 입증되었다. 이처럼 표면에 수식된 유기분자를 Am-Tag라고 한다. 비만 관련 질환과 관련된 adiponectin과 간 질환과 관련된 단백질인 AFP, 이 두 단백질을 가지고 실험을 하였다. 이 방법을 통하여 1~10 aM (아토몰, 10-18 M)의 항원을 초고감도 분석을 증명하였고, 이는 알려진 검출 방법 중에 가장 민감하다고 생각된다. 둘째, 리간드가 수식된 바이오칩에 특이적 결합을 하는 표적 단백질을 정량하기 위해 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하였다. 이 단백질은 트립신(단백질분해효소)에 의해 분해되고 그 결과물인 펩타이드는 동위원소가 있는 내위표준물질과 같이 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석한다. 내위표준물질은 분해된 표적 단백질의 대표하는 펩타이드와 같은 서열을 같지만 다른 분자량을 갖는다. 바이오칩에 특이적으로 결합된 단백질의 절대적인 양은 대표적인 펩타이드와 내위표준물질과의 질량분석기의 질량 세기의 비교로써 정량할 수 있다. 이 두 분석물의 질량 측정 세기는 같은 분자 환경을 갖고 있기 때문에 칩에서의 분석물의 실제 양을 나타낸다. 바이오칩에 고정시킨 GSH(리간드)와 특이적 결합을 하는 GST와 GST가 섞인 단백질을 가지고 실험하였다. 이는 재현성 있게 리간드의 비중에 따라 단백질의 절대 정량을 보여주었다. 진동 수정 마이크로저울 (QCM), 브래드포드 방법, BCA 방법과 같은 현재의 표면-단백질 정량 방법에서 이 방법이 새로운 흥미로운 방법으로 보여줄 수 있을 것이라 생각된다. 마지막으로, 우리는 유기 매트릭스 없이 골드 마이크로 입자를 사용하여 낮은 분자량의 물질들을 분석하였다. 아미노산, 당류, 펩타이드 그리고 이 소분자의 혼합물을 실험하였다. 이 질량 분석기를 이용한 분석은 피크 주변의 어떤 영향 없이 분석물의 이온 피크 만이 나타나는 것을 보여준다. 게다가, thiol이 존재하는 분자들을 혼합된 시료 안에서 금 마이크로 입자와의 특이적 결합을 이용하여 선택적으로 분리하고 분석할 수 있다. 이런 방법은 유기 매트릭스보다 간편하고, 민감도와 선택적 감도가 좋고 재현성이 있다고 생각된다.
Applications of biochemically/biologically functionalized surfaces are now in common for biochemical/biological research. A wide range of biochemical and biological events can be accurately detected and verified reliably on biosurfaces including a variety of biochips and bio(nano)materials. Matrix a...
Applications of biochemically/biologically functionalized surfaces are now in common for biochemical/biological research. A wide range of biochemical and biological events can be accurately detected and verified reliably on biosurfaces including a variety of biochips and bio(nano)materials. Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry has been effective as a new bio-analytical tool because it affords relatively high tolerance of biological contaminants, simple operating processes, and, most importantly, the molecular weight of analytes, which enables label-free assays. In this work, I report three applications utilizing MALDI-TOF MS as a bio-analytical tool. First, I report a new signal amplification method by combining self-assembled monolayers (SAMs) on gold and MALDI-TOF MS, in which a small molecule is utilized as a reporter of the target protein. Our approach uses 2 mm size gold particles which possess the antibody with 5% surface density amongst 95% of oligo(ethylene glycol) moieties. Another antibody is presented on the gold chip which is also passivated with oligo(ethylene glycol). The antigen of interest in solution is then analyzed by sandwich-like assay with the chemically decorated gold chip and gold particles. The presence of antigen was validated indirectly with MALDI-TOF MS by observing oligo(ethylene glycol) moieties on gold particles, which is termed Am-tag. I tested two antigens, adiponectin and AFP (alpha- fetoprotein) as targets. Our strategy demonstrated ultrahigh sensitivity to detect antigens in the range of 1？10 aM, which, to the best of our knowledge, is one of the best sensitivities of detection to date. Secondly, MALDI-TOF MS has been utilized to quantitate proteins which were specifically bound on a ligand-presenting biochip. Subsequently, the bound protein was digested by trypsin and the resulting peptide fragments were analyzed by MALDI-TOF MS in the presence of an isotope-labeled internal standard. The isotope-labeled internal standard has the same sequence as a representative peptide of the target protein digestion but different molecular weight. The absolute amount of the specifically bound protein on a biochip is then quantified by comparing the mass intensities between the representative peptide and the isotope-labeled internal standard. The intensities of these two analytes represent the real amounts of analytes on the chip because they have the same molecular milieu. As a model system, I tested GST and GST-fusion proteins which were captured on glutathione-presenting biochips. I observed that the ligand densities on biochips showed a good correlation with absolute quantity of proteins with excellent reproducibility. I believe the method will be an alternative to current existing tools for surface-protein quantification such as QCM (Quartz Crystal Microbalance), Bradford method, and BCA method. Finally, I used gold microparticles for the analysis of low molecular weight compounds without an organic matrix. Amino acids, sugars, peptides, and the mixture of those molecules were analyzed. The MS analyses gave the spectra showing the apparent molecular ion peaks for analytes without any significant background interference. Furthermore, thiol-containing compounds were selectively extracted from the mixed samples on gold microparticles, which were subsequently analyzed by MS. I believe the method has advantages over organic matrices in terms of simplicity, sensitivity, selectivity, and reproducibility.
Applications of biochemically/biologically functionalized surfaces are now in common for biochemical/biological research. A wide range of biochemical and biological events can be accurately detected and verified reliably on biosurfaces including a variety of biochips and bio(nano)materials. Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry has been effective as a new bio-analytical tool because it affords relatively high tolerance of biological contaminants, simple operating processes, and, most importantly, the molecular weight of analytes, which enables label-free assays. In this work, I report three applications utilizing MALDI-TOF MS as a bio-analytical tool. First, I report a new signal amplification method by combining self-assembled monolayers (SAMs) on gold and MALDI-TOF MS, in which a small molecule is utilized as a reporter of the target protein. Our approach uses 2 mm size gold particles which possess the antibody with 5% surface density amongst 95% of oligo(ethylene glycol) moieties. Another antibody is presented on the gold chip which is also passivated with oligo(ethylene glycol). The antigen of interest in solution is then analyzed by sandwich-like assay with the chemically decorated gold chip and gold particles. The presence of antigen was validated indirectly with MALDI-TOF MS by observing oligo(ethylene glycol) moieties on gold particles, which is termed Am-tag. I tested two antigens, adiponectin and AFP (alpha- fetoprotein) as targets. Our strategy demonstrated ultrahigh sensitivity to detect antigens in the range of 1？10 aM, which, to the best of our knowledge, is one of the best sensitivities of detection to date. Secondly, MALDI-TOF MS has been utilized to quantitate proteins which were specifically bound on a ligand-presenting biochip. Subsequently, the bound protein was digested by trypsin and the resulting peptide fragments were analyzed by MALDI-TOF MS in the presence of an isotope-labeled internal standard. The isotope-labeled internal standard has the same sequence as a representative peptide of the target protein digestion but different molecular weight. The absolute amount of the specifically bound protein on a biochip is then quantified by comparing the mass intensities between the representative peptide and the isotope-labeled internal standard. The intensities of these two analytes represent the real amounts of analytes on the chip because they have the same molecular milieu. As a model system, I tested GST and GST-fusion proteins which were captured on glutathione-presenting biochips. I observed that the ligand densities on biochips showed a good correlation with absolute quantity of proteins with excellent reproducibility. I believe the method will be an alternative to current existing tools for surface-protein quantification such as QCM (Quartz Crystal Microbalance), Bradford method, and BCA method. Finally, I used gold microparticles for the analysis of low molecular weight compounds without an organic matrix. Amino acids, sugars, peptides, and the mixture of those molecules were analyzed. The MS analyses gave the spectra showing the apparent molecular ion peaks for analytes without any significant background interference. Furthermore, thiol-containing compounds were selectively extracted from the mixed samples on gold microparticles, which were subsequently analyzed by MS. I believe the method has advantages over organic matrices in terms of simplicity, sensitivity, selectivity, and reproducibility.
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.