호냉성 박테리아는 그들의 추운 환경에서 살아남기 위해 0℃만큼 낮은 온도에서도 생존 능력이 있다. 아마도 이들이 저온에 적응하여 살아남을 수 있는 이유에는 DnaK가 영향을 미치는 것으로 보인다. DnaK는 Hsp70 familly에 속하는 분자 샤페론으로 folding이 안되어 있거나 부분적으로만 folding 되어 있는 단백질과 결합하여 이 단백질의 활성이 감소되는 것을 막아주는 역할을 한다. 이때, DnaK는 ATPase 활성을 가지고 있어서, 표적 단백질과 결합하여 안정화시키는데 있어 ...
호냉성 박테리아는 그들의 추운 환경에서 살아남기 위해 0℃만큼 낮은 온도에서도 생존 능력이 있다. 아마도 이들이 저온에 적응하여 살아남을 수 있는 이유에는 DnaK가 영향을 미치는 것으로 보인다. DnaK는 Hsp70 familly에 속하는 분자 샤페론으로 folding이 안되어 있거나 부분적으로만 folding 되어 있는 단백질과 결합하여 이 단백질의 활성이 감소되는 것을 막아주는 역할을 한다. 이때, DnaK는 ATPase 활성을 가지고 있어서, 표적 단백질과 결합하여 안정화시키는데 있어 ATP 가수분해와 밀접하게 관련이 있다. 본 연구에서는 극지에서 생존하는 호냉성 박테리아인 strain NO.KOPRI 22215의 아직 밝혀지지 않은 dnaK의 염기서열을 다른 종들의 dnaK와 상동성을 가지는 염기서열을 이용하여 primer를 제작하고, gradient PCR(polymerase chain reaction)과 LA PCR in vitro cloning을 통해 dnaK의 완전한 염기서열뿐만 아니라 promoter site를 포함한 up-stream 염기서열까지 알아내었다. 계속해서 다양한 vector plasmid에 dnaK를 Cloning 후 과발현시켜, spotting assay와 counting assay를 이용한 저온에서의 세포 생존률을 관찰하여 극지박테리아의 dnaK의 존재 여부에 따른 cold-adatation을 확인하였다. 계속해서, malachite green method를 이용하여 PaDnaK의 ATPase activity를 측정하였고, Refolding assay of Citrate Synthase를 통해 PaDnaK의 Chaperon activity를 E.coli DnaK와 비교하여 측정하였다.
호냉성 박테리아는 그들의 추운 환경에서 살아남기 위해 0℃만큼 낮은 온도에서도 생존 능력이 있다. 아마도 이들이 저온에 적응하여 살아남을 수 있는 이유에는 DnaK가 영향을 미치는 것으로 보인다. DnaK는 Hsp70 familly에 속하는 분자 샤페론으로 folding이 안되어 있거나 부분적으로만 folding 되어 있는 단백질과 결합하여 이 단백질의 활성이 감소되는 것을 막아주는 역할을 한다. 이때, DnaK는 ATPase 활성을 가지고 있어서, 표적 단백질과 결합하여 안정화시키는데 있어 ATP 가수분해와 밀접하게 관련이 있다. 본 연구에서는 극지에서 생존하는 호냉성 박테리아인 strain NO.KOPRI 22215의 아직 밝혀지지 않은 dnaK의 염기서열을 다른 종들의 dnaK와 상동성을 가지는 염기서열을 이용하여 primer를 제작하고, gradient PCR(polymerase chain reaction)과 LA PCR in vitro cloning을 통해 dnaK의 완전한 염기서열뿐만 아니라 promoter site를 포함한 up-stream 염기서열까지 알아내었다. 계속해서 다양한 vector plasmid에 dnaK를 Cloning 후 과발현시켜, spotting assay와 counting assay를 이용한 저온에서의 세포 생존률을 관찰하여 극지박테리아의 dnaK의 존재 여부에 따른 cold-adatation을 확인하였다. 계속해서, malachite green method를 이용하여 PaDnaK의 ATPase activity를 측정하였고, Refolding assay of Citrate Synthase를 통해 PaDnaK의 Chaperon activity를 E.coli DnaK와 비교하여 측정하였다.
Psychrophilic bacteria are capable of growing at temperatures as low as 0℃. Since they live in cold environments, they probably have developed a survival strategy against freezing temperatures. The molecular chaperones, DnaKs of cold-adapted bacteria, which belong to the 70-kDa heat shock protein (H...
Psychrophilic bacteria are capable of growing at temperatures as low as 0℃. Since they live in cold environments, they probably have developed a survival strategy against freezing temperatures. The molecular chaperones, DnaKs of cold-adapted bacteria, which belong to the 70-kDa heat shock protein (Hsp70) are probably characterized by their cold-active properties, such as the high ATPase activity at low temperatures. Using a combination of PCR technologies based on homologous sequence alignments, we were able to determine the nucleotide sequence of the dnaK genes from unknown genomes of some psychrophilic bacteria. Subsequent cloning and expression of the dnaK genes in E.coli expression system was successfully carried out. We examined the role of expressed psychrophilic bacterial DnaK on cell viability after cold treatment. And the ATPase activity of DnaK was measured by malachite green method in vitro. Finally, Chaperone activity of DnaK was measured by refolding of Citrate synthase assay in vitro.
Psychrophilic bacteria are capable of growing at temperatures as low as 0℃. Since they live in cold environments, they probably have developed a survival strategy against freezing temperatures. The molecular chaperones, DnaKs of cold-adapted bacteria, which belong to the 70-kDa heat shock protein (Hsp70) are probably characterized by their cold-active properties, such as the high ATPase activity at low temperatures. Using a combination of PCR technologies based on homologous sequence alignments, we were able to determine the nucleotide sequence of the dnaK genes from unknown genomes of some psychrophilic bacteria. Subsequent cloning and expression of the dnaK genes in E.coli expression system was successfully carried out. We examined the role of expressed psychrophilic bacterial DnaK on cell viability after cold treatment. And the ATPase activity of DnaK was measured by malachite green method in vitro. Finally, Chaperone activity of DnaK was measured by refolding of Citrate synthase assay in vitro.
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