[학위논문]조기 난소 부전 환자의 사립체 DNA(mtDNA) 전체 염기 서열 분석 A High-Throughput Sequencing Microarray for Mitochondrial Mutation detection in Premature Ovarian Failure (POF)원문보기
원인 불명의 조기 난소 부전 환자에서 GeneChip® Human Mitochondrial Resequencing Array 2.0 을 이용하여 사립체 DNA 전체 염기 서열을 분석해 이를 정상 여성의 것과 비교, 향후 조기 난소 부전의 선별검사로서의 응용가치를 알아보고자 한다. 환자군과 대조군을 대상으로 좌상완 전박부에서 정맥 전혈 5 ㎖를 채취한 후 15% ...
원인 불명의 조기 난소 부전 환자에서 GeneChip® Human Mitochondrial Resequencing Array 2.0 을 이용하여 사립체 DNA 전체 염기 서열을 분석해 이를 정상 여성의 것과 비교, 향후 조기 난소 부전의 선별검사로서의 응용가치를 알아보고자 한다. 환자군과 대조군을 대상으로 좌상완 전박부에서 정맥 전혈 5 ㎖를 채취한 후 15% EDTA 100 ㎕ Vacutainer® 관에 수집하여, 1) Genomic DNA 추출, 2) 중합효소 연쇄반응, 저류 (pooling), DNA 분절화 (fragmentation) 및 표지 (labeling), 3) 칩의 보합결합 (hybridization), 스캐닝 (scanning) 및 자료 분석 (data analysis) 를 시행하였다. Mitochip은 CEl. File 을 만들기 위해 Affymetrix GeneChip scanner 3000을 이용하여 스캔하였고, 자료 분석을 위해 Affymetrix Genchip® Operating Software 1.4 (GCOS 1.4)와 Genchip® Sequence Analysis Software (GSEQ 4.0) 두개의 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 대조군과 조기 난소 부전 환자의 혈액에서 추출된 DNA에서 GeneChip® Human Mitochondrial Resequencing Array 2.0 을 이용하여 사립체 DNA의 전체 염기 서열을 분석하였다. 총 Mitochip은 두 가닥의 DNA로 플라즈미드 (plasmid) DNA 염기 서열을 포함하여 37,759 base pairs (bp)로 구성되어 있으며, Affymetrix Genchip® Operating Software 1.4 (GCOS 1.4)에 의해 대조군과 조기 난소 부전에서 각각 31,011 bp와 31,253 bp가 일치되는 결과를 얻었다. 대조군과 조기 난소 부전 환자 각각의 call rate는 84.14%와 82.78% 였다. GeneChip® Human Mitochondrial Resequencing Array 2.0 의 염기는 MITOMAP Database Revised Cambridge Reference Sequence (RCRS) 에서 선별되었다. 대조군과 조기 난소 부전 환자에서 염기 서열을 비교한 결과 염기 서열에 차이를 보이는 곳이 27개 발견되었으며, 그 중 RCRS 염기 서열과 조기 난소 부전 환자의 염기 서열이 같고 대조군이 다른 곳이 15개로 확인되었고, RCRS 염기 서열과 대조군의 염기 서열이 같고 조기 난소 부전 환자에서만 변화를 보이는 부위가 12곳이 확인되었다. 후자 중 부호화 (coding) 부위에서는 11개의 변이가 발견되었고, 변이는 부호화 (coding) 부위 전반에 고루 분포되었다. 비부호화 (non-coding) 부위에서는 한 개의 변이가 발견되었다. 본 실험 결과는 조기 난소 부전의 선별검사에 대한 지표로서 사립체 DNA의 전체 염기 서열을 분석하는데 대한 근거를 제시하였으며, 이를 응용하여 향후 임상 적용이 가능한 선별검사를 고안할 수 있을 것이다.
원인 불명의 조기 난소 부전 환자에서 GeneChip® Human Mitochondrial Resequencing Array 2.0 을 이용하여 사립체 DNA 전체 염기 서열을 분석해 이를 정상 여성의 것과 비교, 향후 조기 난소 부전의 선별검사로서의 응용가치를 알아보고자 한다. 환자군과 대조군을 대상으로 좌상완 전박부에서 정맥 전혈 5 ㎖를 채취한 후 15% EDTA 100 ㎕ Vacutainer® 관에 수집하여, 1) Genomic DNA 추출, 2) 중합효소 연쇄반응, 저류 (pooling), DNA 분절화 (fragmentation) 및 표지 (labeling), 3) 칩의 보합결합 (hybridization), 스캐닝 (scanning) 및 자료 분석 (data analysis) 를 시행하였다. Mitochip은 CEl. File 을 만들기 위해 Affymetrix GeneChip scanner 3000을 이용하여 스캔하였고, 자료 분석을 위해 Affymetrix Genchip® Operating Software 1.4 (GCOS 1.4)와 Genchip® Sequence Analysis Software (GSEQ 4.0) 두개의 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 대조군과 조기 난소 부전 환자의 혈액에서 추출된 DNA에서 GeneChip® Human Mitochondrial Resequencing Array 2.0 을 이용하여 사립체 DNA의 전체 염기 서열을 분석하였다. 총 Mitochip은 두 가닥의 DNA로 플라즈미드 (plasmid) DNA 염기 서열을 포함하여 37,759 base pairs (bp)로 구성되어 있으며, Affymetrix Genchip® Operating Software 1.4 (GCOS 1.4)에 의해 대조군과 조기 난소 부전에서 각각 31,011 bp와 31,253 bp가 일치되는 결과를 얻었다. 대조군과 조기 난소 부전 환자 각각의 call rate는 84.14%와 82.78% 였다. GeneChip® Human Mitochondrial Resequencing Array 2.0 의 염기는 MITOMAP Database Revised Cambridge Reference Sequence (RCRS) 에서 선별되었다. 대조군과 조기 난소 부전 환자에서 염기 서열을 비교한 결과 염기 서열에 차이를 보이는 곳이 27개 발견되었으며, 그 중 RCRS 염기 서열과 조기 난소 부전 환자의 염기 서열이 같고 대조군이 다른 곳이 15개로 확인되었고, RCRS 염기 서열과 대조군의 염기 서열이 같고 조기 난소 부전 환자에서만 변화를 보이는 부위가 12곳이 확인되었다. 후자 중 부호화 (coding) 부위에서는 11개의 변이가 발견되었고, 변이는 부호화 (coding) 부위 전반에 고루 분포되었다. 비부호화 (non-coding) 부위에서는 한 개의 변이가 발견되었다. 본 실험 결과는 조기 난소 부전의 선별검사에 대한 지표로서 사립체 DNA의 전체 염기 서열을 분석하는데 대한 근거를 제시하였으며, 이를 응용하여 향후 임상 적용이 가능한 선별검사를 고안할 수 있을 것이다.
We want to know the value of application of mtDNA sequencing using GeneChip® Human Mitochondrial Resequencing Array 2.0 in screening of patients with unexplained premature ovarian failure (POF). Peripheral venous blood samples were collected from a control and a patient with POF. Mitochondrial D...
We want to know the value of application of mtDNA sequencing using GeneChip® Human Mitochondrial Resequencing Array 2.0 in screening of patients with unexplained premature ovarian failure (POF). Peripheral venous blood samples were collected from a control and a patient with POF. Mitochondrial DNA sequencing was performed as follows, 1) DNA extraction, 2) PCR, pooing, and DNA fragmentation, 3) chip hybridization, scanning, and data analysis. Analysis of data was performed using Affymetrix Genchip® Operating Software 1.4 (GCOS 1.4) and Genchip® Sequence Analysis Software (GSEQ 4.0). A total of 37,759 base pairs of mtDNA were sequenced. Using Affymetrix Genchip® Operating Software 1.4 (GCOS 1.4), 31,011 base pairs were assigned in the control group and 31,253 base pairs were assigned in the POF group. Each call rate was 84.14% and 82.78%. We found 27 discordant base calls between the control group and the POF group. Fifteen of 27 were discordant in the only POF group in comparison with RCRS. Twelve of 27 were discordant in the only control group in comparison with RCRS. The sequence alterations were widely distributed. This is the first study to demonstrate feasibility of using an array-based approach for complete mitochondrial sequencing of POF patient and adds to the cumulative evidence that mtDNA is a rationale biomarker for the early detection of POF.
We want to know the value of application of mtDNA sequencing using GeneChip® Human Mitochondrial Resequencing Array 2.0 in screening of patients with unexplained premature ovarian failure (POF). Peripheral venous blood samples were collected from a control and a patient with POF. Mitochondrial DNA sequencing was performed as follows, 1) DNA extraction, 2) PCR, pooing, and DNA fragmentation, 3) chip hybridization, scanning, and data analysis. Analysis of data was performed using Affymetrix Genchip® Operating Software 1.4 (GCOS 1.4) and Genchip® Sequence Analysis Software (GSEQ 4.0). A total of 37,759 base pairs of mtDNA were sequenced. Using Affymetrix Genchip® Operating Software 1.4 (GCOS 1.4), 31,011 base pairs were assigned in the control group and 31,253 base pairs were assigned in the POF group. Each call rate was 84.14% and 82.78%. We found 27 discordant base calls between the control group and the POF group. Fifteen of 27 were discordant in the only POF group in comparison with RCRS. Twelve of 27 were discordant in the only control group in comparison with RCRS. The sequence alterations were widely distributed. This is the first study to demonstrate feasibility of using an array-based approach for complete mitochondrial sequencing of POF patient and adds to the cumulative evidence that mtDNA is a rationale biomarker for the early detection of POF.
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