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Ribonuclease inhibitor (RI)는 세포 내에 존재하는 분자량 50kDa의 산성 효소이다. Leucine-rich repeat (LRR)을 가지고 있으며 다량의 Leu과 Cys로 이루어져있는, 유명한 단백질 중 한가지 이다. 우리는 인간 태반에서 만들어진 cDNA library로부터 PCR을 통해 HRI 유전자를 분리해낸 후 att site가 있는 pMal-c2 ...

Ribonuclease inhibitor (RI)는 세포 내에 존재하는 분자량 50kDa의 산성 효소이다. Leucine-rich repeat (LRR)을 가지고 있으며 다량의 Leu과 Cys로 이루어져있는, 유명한 단백질 중 한가지 이다. 우리는 인간 태반에서 만들어진 cDNA library로부터 PCR을 통해 HRI 유전자를 분리해낸 후 att site가 있는 pMal-c2 벡터에 클로닝 하였다. DNA-sequencing을 통해 HRI 유전자 서열을 확인하였다. IPTG induction으로 대장균에서 MBP와 결합되어있는 HRI를 발현시킨 후 amylose resin을 사용한 크로마토그래프 방법으로 정제하였다. HRI의 여가는 Blackburn의 PCA-침전 방법을 사용하여, RNA를 RNaseA와 HRI가 존재하는 용액에 처리한 후 분해된 RNA의 농도를 측정하고 gel에 전기영동하여 밴드를 확인함으로 측정하였다. 실험 결과, HRI는 RNase A의 RNA 분해활성을 완전히 억제하며, HRI의 활성은 50℃에서도 유지된다는 것을 확인하였다. 여가 확인 후, HRI gene을 종자특이 발현 프로모터인 Rab21과 선발 유전자인Bar가있는 pSBRbHGt2WiG 벡터에 클로닝 하였다. Agrobacterium을 사용하여 벼 (Oryza sativa cv. Nakdong)에서 유도된 캘러스에 pSBRbHGt2WiG 벡터를 형질전환 시키고 T-DNA flanking sequencing을 통해 T-DNA의 삽입 위치를 확인하였다. 형질전환 벼의 쌀로부터 RNA와 protein을 분리해낸 후 RT-PCA과 western blot을 통해서 HRI gene의 전사와 번역을 확인하였다. 이 연구를 통해, 우리는 pSBRbHGt2WiG 벡터를 사용해 HRI를 형질전환 벼의 쌀에서 발현시키는 실험을 진행하였다. 결과적으로 HRI는 쌀에서 성공적으로 발현한 것을 확인하였다. 또한 우리는 이 단백질 발현 시스템을 다른 다양한 단백질을 쌀에서 발현시키는데 적용할 수 있을 것으로 예상한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Ribonuclease inhibitor (RI) is an acidic cytoplasmic enzyme of molecular weight of 50kDa. It is one of the well known proteins having leucine-rich repeat (LRR) and high content of Leu and Cys. RI inhibits RNA degrading activity by forming a 1:1 complex with RNase A. Human placental ribonuclease inhi...

Ribonuclease inhibitor (RI) is an acidic cytoplasmic enzyme of molecular weight of 50kDa. It is one of the well known proteins having leucine-rich repeat (LRR) and high content of Leu and Cys. RI inhibits RNA degrading activity by forming a 1:1 complex with RNase A. Human placental ribonuclease inhibitor (HRI) gene was isolated from human placental cDNA library by PCR and cloned into attachment site inserted in pMal-c2 vector. HRI sequence was confirmed by DNA sequencing. HRI fused with maltose binding protein (MBP) was expressed in E.coli by IPTG induction and purified by affinity chromatography on amylose resin. The activity of HRI was assayed by PCA (Perchloric acid)-precipitation method of Blackburn. The concentration of degraded RNA was measured by incubating rice total RNA with RNase A in the presence of HRI. Their sizes were observed by gel electrophoresis. The results showed that HRI inhibited RNase A activity completely and HRI activity was maintained at 50℃. HRI gene was inserted into pSBRbHGt2WiG vector which has Rab21 promoter to express in rice and Bar gene as a selection marker by Gateway system. Callus of rice cultivar (Oryza sativa cv. Nakdong) was transformed with Agrobacterium. Insertion sites of the gene were analyzed by T-DNA flanking sequencing. From transgenic rice grains, total RNA and proteins extracted for transcription and translation analysis by RT-PCR and western blotting. In this study, the expression of HRI in transgenic rice grains was performed under the Rab21 promoter. The results demonstrated that HRI was successfully expressed in rice grain.

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