이 연구의 목표는 인체감염성이며 항생제내성 병원균인 Enterobacter 종의 박테리아에 대한 치료용 박테리오 파지를 탐색하는 것이다. 이상의 목료를 달성하기 위하여 본 연구에서는 인체감염성 병원균을 죽 일수 있는 용해 성 파 아 지를 경북 경산시 근처의 대구대학교 근처 저수지에서 분리하였다. K113이라 명명된 박테리아가 분리되었으며, 경북대학교 병원에서 Walk Away Analyzer를 이용하여 이 균주의 생화학적 및 항생제 저항성이 결정되었다.
이 균 주는 Gram 음성, 막대형의 형태를 갖고 있으며 eosin methylene bule ...
이 연구의 목표는 인체감염성이며 항생제내성 병원균인 Enterobacter 종의 박테리아에 대한 치료용 박테리오 파지를 탐색하는 것이다. 이상의 목료를 달성하기 위하여 본 연구에서는 인체감염성 병원균을 죽 일수 있는 용해 성 파 아 지를 경북 경산시 근처의 대구대학교 근처 저수지에서 분리하였다. K113이라 명명된 박테리아가 분리되었으며, 경북대학교 병원에서 Walk Away Analyzer를 이용하여 이 균주의 생화학적 및 항생제 저항성이 결정되었다.
이 균 주는 Gram 음성, 막대형의 형태를 갖고 있으며 eosin methylene bule agar 배지에서 분홍에서 보라색의 점액질 콜로니를 형성하였으며, oxi-ferment/enterotube 양성 및 oxidase와 indole 음성임으로 Enterobacteriaceae family에 속하였다.
또한 이 균 주는 glucose, raffinose, inositol, lysine, citrate, succinate, rahmnose, adonitol, arginine, esculin, maltose, nitrate, tartrate, sorbitol, arabinose, melibiose, ornithine, Voges Proskauser, o-nitrate phosphoglutarate 시험에서 양성이었다. 이에 비해 urea, phenylalanine, acetate, hydrogen sulphide, cetrizine 시험에서는 음성이었다.
그리고 항생제 저항성 시험에서 이 균 주는 Ampicilin (>16 µg ml ^(-1)), Cefazolin (>16 µg ml ^(-1)), Vancomycin (>200 µg ml ^(-1)) 등의 항생제에 대하여 저항성을 나타내었다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 분자분류를 수행한 결과 이 균주는 E. aerogenes와 100% 유사성을 나타냄으로 Enterobacter aerogenes K113 균 주로 최종 확인되었다.
용해 성 파지 분리는 확인된 K113 균주를 대상으로 탐색하였으며, 그 결과 F20 으로 명명된 새로운 파지 룰 성공적으로 분리하였다. 이 파지는 숙주인 K113에 잘 감염하여 배지 위에서 직경이 2 – 3 mm인 큰 플라크 를 형성하였다. 이 파지의 숙주범위를 조사한 결과 E. aerogenes, Acinetobacter baumannii, Bacillus subtilis, B. cereus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, S. typhimurium, Staphylococcus aureus 등 시험한 33종의 균주 중에서 Enterobacteriaceae family에 속하는 2종 즉 E. aerogenes K113과 E. aerogenes ATCC 13048만 감염하여 용해하였기 때문에 좁은 숙주범위를 갖고 있음을 확인하였다. 투과전자현미경에 의한 형태관찰 결과 이 파지는 직경 50 ηm 크기의 아이소메트릭 머리와 150 ηm의 길이와 10 ηm의 폭을 갖는 꼬리를 갖고 있었다. 제한효소 분석 결과 이 파지는 선형의 이중나선 DNA를 갖는 파지로 확인되었다.
또한 이 파지의 전체 유전체에 대한 염기서열을 분석한 결과 총 51,543의 염기 쌍과 47.9%의 GC 함량을 갖고 있었다. 이상의 결과로부터 F20 파지는 Siphoviridae family의 T1 유사 파지로 최종 확인되었다.
또한 이 파지의 감염증식 율 (MOI) 및 pH, 열, 독성 화학물질, 자외선 등에 대한 안정성, biofilm 저해 율과 같은 특징들도 결정하였다. MOI는 숙주세포당 파지의 비율이 1:10으로 확인되었다. pH 안정성은 매우 높아서 이 파지는pH 4 - 11까지 안정하였으며, 10% (V/V) 클로로포름과 에탄올에서도 상온에서 2시간 동안 안정하였다. 그러나 자외선에는 매우 불안정하여 254 ηm의 자외선 파장에 노출되면 40초 이내에 완전히 사멸하였다. 이 파지는 열 안정성은 매우 높아서 25 – 70 °C에서 거의 개체 수 감소 없이 150분간 안정하였다. 1% LB 배지, glycerol, skim milk, glycine, D-sorbitol, gelatin 등의 안정제를 첨가하여 장기안정성을 조사한 결과 25 °C에서 6개월간 안정하였다. Biofilm 생성 저해효과는 E. aerogenes K113 균 주에 대하여 이 파지는108 pfu ml ^(-1)농도까지 농도의존적인 것으로 관찰되었으며, 최대 60%까지 저해하였다.
비교유전체 학 연구를 위하여 파지의 전체 유전체 염기서열에 대하여 파지 유전체와 유사 종 파지 구조유전자와의 유사성에 대하여 생물정보 학 도구를 사용하여 분석하였다. 그 결과 F20 파지는 T1, TLS, RTP 파지와 유사한 것으로 확인되었으며, 이와 같은 결과는 분자계통학적 연구와 dot-plot 분석 결과와도 정확히 일치하였다. 그러나 높은 유사성에도 불구하고 부분적으로 차이가 발견되었다. 즉 기대 밖으로 이 파지는 34.9%의 구조유전자가 다른 파지와 전혀 일치하지 않았다.
인체에 대한 임상시험을 위하여 in vitro에서 파지의 인간혈액과의 상호작용에 대하여 연구하였다. 그 결과 파지는 3시간까지 50%가 혈액에 흡착하였으나 이후 6시간까지 더 이상의 흡착은 일어나지 않았다. 또한 숙주 박테리아와 파지를 혈액에 단계적으로 처리했을 때 파지는 숙주 박테리아만을 용해하였으며 적혈구에는 전혀 작용하지 않았다. 따라서 이 결과는 파지가 인간 혈액에는 매우 안전하고 숙주인 병원균만을 공격함을 알 수 있다.
또한 백혈구의 일종인 polymorphonuclear leukocytes (PMNs)에서 Gram 음성 박테리아의 lipopolysaccharides (LPS)에 의하여 유발되는 활성산소 (ROS)의 생성에 미치는 파지의 효과를 평가했을 때 이 파지는 109 pfu ml ^(-1)농도에서 E. aerogenes K113의 LPS에 의하여 유발된 ROS 생성을 50%까지 억제하였다. 그러나 이 파지는 E. coli ATCC 10536, E. coli ATCC 8739, E. coli:0157 KCTC 14034와 같은 다른 비 숙주 박테리아의 LPS에 의하여 유발된 ROS는 감소시키지 않았다. 그리고 양성 대조구로서 상업적으로 판매되는 E. coli B의 LPS와 250 mM의 melatonin 을 처리했을 때 20%의 ROS 감소가 관찰되었다. 이상의 결과는 F20 파지가 박테리아 성 병원균이 대량 감염하여 조직과 기관의 손상에 따른 ROS 생성이 발생했을 때 병원성 세균감염에 따른 내 독소의 독성효과를 경감하는 방안으로 실제적인 임상적 활용이 가능함을 나타낸다.
이상의 발견으로부터 F20 파지는 인체감염성 항생제 내성 균인 E. aerogenes 감염에 대한 파지치료제로 활용할 수 있을 것이다. 또한 이 파지는 LPS에 의해 유도되는 인간 백혈구의 일종인 PMNs에서의 ROS 생성억제에 이용될 수 있을 것이다. 뿐만 아니라 비교유전체 학을 활용하여 이 파지는 파지치료, 파지 display 등 다양한 파지 응용분야에서 중요한 정보를 제공할 것이다.
이 연구의 목표는 인체감염성이며 항생제내성 병원균인 Enterobacter 종의 박테리아에 대한 치료용 박테리오 파지를 탐색하는 것이다. 이상의 목료를 달성하기 위하여 본 연구에서는 인체감염성 병원균을 죽 일수 있는 용해 성 파 아 지를 경북 경산시 근처의 대구대학교 근처 저수지에서 분리하였다. K113이라 명명된 박테리아가 분리되었으며, 경북대학교 병원에서 Walk Away Analyzer를 이용하여 이 균주의 생화학적 및 항생제 저항성이 결정되었다.
이 균 주는 Gram 음성, 막대형의 형태를 갖고 있으며 eosin methylene bule agar 배지에서 분홍에서 보라색의 점액질 콜로니를 형성하였으며, oxi-ferment/enterotube 양성 및 oxidase와 indole 음성임으로 Enterobacteriaceae family에 속하였다.
또한 이 균 주는 glucose, raffinose, inositol, lysine, citrate, succinate, rahmnose, adonitol, arginine, esculin, maltose, nitrate, tartrate, sorbitol, arabinose, melibiose, ornithine, Voges Proskauser, o-nitrate phosphoglutarate 시험에서 양성이었다. 이에 비해 urea, phenylalanine, acetate, hydrogen sulphide, cetrizine 시험에서는 음성이었다.
그리고 항생제 저항성 시험에서 이 균 주는 Ampicilin (>16 µg ml ^(-1)), Cefazolin (>16 µg ml ^(-1)), Vancomycin (>200 µg ml ^(-1)) 등의 항생제에 대하여 저항성을 나타내었다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 분자분류를 수행한 결과 이 균주는 E. aerogenes와 100% 유사성을 나타냄으로 Enterobacter aerogenes K113 균 주로 최종 확인되었다.
용해 성 파지 분리는 확인된 K113 균주를 대상으로 탐색하였으며, 그 결과 F20 으로 명명된 새로운 파지 룰 성공적으로 분리하였다. 이 파지는 숙주인 K113에 잘 감염하여 배지 위에서 직경이 2 – 3 mm인 큰 플라크 를 형성하였다. 이 파지의 숙주범위를 조사한 결과 E. aerogenes, Acinetobacter baumannii, Bacillus subtilis, B. cereus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, S. typhimurium, Staphylococcus aureus 등 시험한 33종의 균주 중에서 Enterobacteriaceae family에 속하는 2종 즉 E. aerogenes K113과 E. aerogenes ATCC 13048만 감염하여 용해하였기 때문에 좁은 숙주범위를 갖고 있음을 확인하였다. 투과전자현미경에 의한 형태관찰 결과 이 파지는 직경 50 ηm 크기의 아이소메트릭 머리와 150 ηm의 길이와 10 ηm의 폭을 갖는 꼬리를 갖고 있었다. 제한효소 분석 결과 이 파지는 선형의 이중나선 DNA를 갖는 파지로 확인되었다.
또한 이 파지의 전체 유전체에 대한 염기서열을 분석한 결과 총 51,543의 염기 쌍과 47.9%의 GC 함량을 갖고 있었다. 이상의 결과로부터 F20 파지는 Siphoviridae family의 T1 유사 파지로 최종 확인되었다.
또한 이 파지의 감염증식 율 (MOI) 및 pH, 열, 독성 화학물질, 자외선 등에 대한 안정성, biofilm 저해 율과 같은 특징들도 결정하였다. MOI는 숙주세포당 파지의 비율이 1:10으로 확인되었다. pH 안정성은 매우 높아서 이 파지는pH 4 - 11까지 안정하였으며, 10% (V/V) 클로로포름과 에탄올에서도 상온에서 2시간 동안 안정하였다. 그러나 자외선에는 매우 불안정하여 254 ηm의 자외선 파장에 노출되면 40초 이내에 완전히 사멸하였다. 이 파지는 열 안정성은 매우 높아서 25 – 70 °C에서 거의 개체 수 감소 없이 150분간 안정하였다. 1% LB 배지, glycerol, skim milk, glycine, D-sorbitol, gelatin 등의 안정제를 첨가하여 장기안정성을 조사한 결과 25 °C에서 6개월간 안정하였다. Biofilm 생성 저해효과는 E. aerogenes K113 균 주에 대하여 이 파지는108 pfu ml ^(-1)농도까지 농도의존적인 것으로 관찰되었으며, 최대 60%까지 저해하였다.
비교유전체 학 연구를 위하여 파지의 전체 유전체 염기서열에 대하여 파지 유전체와 유사 종 파지 구조유전자와의 유사성에 대하여 생물정보 학 도구를 사용하여 분석하였다. 그 결과 F20 파지는 T1, TLS, RTP 파지와 유사한 것으로 확인되었으며, 이와 같은 결과는 분자계통학적 연구와 dot-plot 분석 결과와도 정확히 일치하였다. 그러나 높은 유사성에도 불구하고 부분적으로 차이가 발견되었다. 즉 기대 밖으로 이 파지는 34.9%의 구조유전자가 다른 파지와 전혀 일치하지 않았다.
인체에 대한 임상시험을 위하여 in vitro에서 파지의 인간혈액과의 상호작용에 대하여 연구하였다. 그 결과 파지는 3시간까지 50%가 혈액에 흡착하였으나 이후 6시간까지 더 이상의 흡착은 일어나지 않았다. 또한 숙주 박테리아와 파지를 혈액에 단계적으로 처리했을 때 파지는 숙주 박테리아만을 용해하였으며 적혈구에는 전혀 작용하지 않았다. 따라서 이 결과는 파지가 인간 혈액에는 매우 안전하고 숙주인 병원균만을 공격함을 알 수 있다.
또한 백혈구의 일종인 polymorphonuclear leukocytes (PMNs)에서 Gram 음성 박테리아의 lipopolysaccharides (LPS)에 의하여 유발되는 활성산소 (ROS)의 생성에 미치는 파지의 효과를 평가했을 때 이 파지는 109 pfu ml ^(-1)농도에서 E. aerogenes K113의 LPS에 의하여 유발된 ROS 생성을 50%까지 억제하였다. 그러나 이 파지는 E. coli ATCC 10536, E. coli ATCC 8739, E. coli:0157 KCTC 14034와 같은 다른 비 숙주 박테리아의 LPS에 의하여 유발된 ROS는 감소시키지 않았다. 그리고 양성 대조구로서 상업적으로 판매되는 E. coli B의 LPS와 250 mM의 melatonin 을 처리했을 때 20%의 ROS 감소가 관찰되었다. 이상의 결과는 F20 파지가 박테리아 성 병원균이 대량 감염하여 조직과 기관의 손상에 따른 ROS 생성이 발생했을 때 병원성 세균감염에 따른 내 독소의 독성효과를 경감하는 방안으로 실제적인 임상적 활용이 가능함을 나타낸다.
이상의 발견으로부터 F20 파지는 인체감염성 항생제 내성 균인 E. aerogenes 감염에 대한 파지치료제로 활용할 수 있을 것이다. 또한 이 파지는 LPS에 의해 유도되는 인간 백혈구의 일종인 PMNs에서의 ROS 생성억제에 이용될 수 있을 것이다. 뿐만 아니라 비교유전체 학을 활용하여 이 파지는 파지치료, 파지 display 등 다양한 파지 응용분야에서 중요한 정보를 제공할 것이다.
The aim of this study was to investigate a bacteriophage for its therapeutic approach against human-infectious and drug-resistant bacterial pathogens of Enterobacter species. In this study, a lytic phage was isolated from a lake near Daegu University, Gyoungsan city, Republic of Korea, to target hum...
The aim of this study was to investigate a bacteriophage for its therapeutic approach against human-infectious and drug-resistant bacterial pathogens of Enterobacter species. In this study, a lytic phage was isolated from a lake near Daegu University, Gyoungsan city, Republic of Korea, to target human-infectious bacterial pathogens.
A bacterium named K113 was isolated, and subjected to biochemical characterization and drug-resistance determination using Walk Away Analyzer at the Hospital of Kyoungpook National University, Daegu city, Republic of Korea. The K113 exhibited biochemical characteristics of Enterobacteriaceae family such as Gram-negative and rod shaped bacterium, formation of large mucoid colonies of pink to purple on eosin methylene blue agar, oxi-ferment/enterotube positive, and oxidase and indole negative. Moreover, it was positive for glucose, raffinose, inositol, lysine, citrate, succinate, rahmnose, adonitol, arginine, esculin, maltose, nitrate, tartrate, sorbitol, arabinose, melibiose, ornithine, Voges Proskauer and o-nitrate phosphoglutarate test. On the other hand, it was negative for urea, phenylalanine, acetate, hydrogen sulphide and cetrizine. Importantly, it was resistant to the antibiotics such as Ampicilin (>16 µg ml^(-1)), Cefazolin (>16 µg ml^(-1)) and Vancomycin (>200 µg ml^(-1)). Molecular characterization of K113 by 16S rRNA gene sequencing exhibited 100% similarity to E. aerogenes. Hence, it was identified as Enterobacter aerogenes K113.
Lytic phage isolation was targeted against E. aerogenes K113 strain and a noble phage, named F20, was successfully isolated. This phage resulted in a good infection to the host K113 by showing the big size plaques (2–3 mm in diameter). The phage exhibited host specificity by lysing only two of the strains of Enterobactereaceae family (E. aerogenes K113 and E. aerogenes ATCC 13048) among the thirty-three tested strains; Acinetobacter baumannii, Bacillus subtilis, B. cereus, E. aerogenes, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeroginosa, Salmonella enteritidis, S. typhimurium and Staphylococcus aureus. Morphological analysis of the phage by transmission electron microscopy (TEM) revealed that it had an isometric head (50 ηm in diameter) and a long tail (150 ηm long and 10 ηm wide). Restriction enzyme analysis revealed that F20 was a linear dsDNA phage. Molecular characterization of the phage was conducted by sequencing of its whole genome that comprised 51,543 bp with total GC content of 47.9%. On the basis of the results obtained from TEM, restriction enzyme analysis and whole genome sequencing, F20 was identified as a T1 like phage under the Siphoviridae family of viruses.
In addition, other parameters of the phage were also studied for its multiplicity of infection (MOI), stability at different pH, temperatures, chemicals and ultraviolet (UV) radiation, and biofilm inhibition. The MOI was found to be 1:10 of phage particle per host cells. Phage F20 was stable at pH from 4 to 11, and resistant to chemicals such as chloroform and ethanol (10%, v/v) for upto 2 h at room temperature. It was highly sensitive to UV radiation (254 ηm) and killed within 40 sec, completely. The phage showed high thermal stability at temperature between 25 to 70°C with no significant reduction in titer upto 150 min. Long term stability was conducted for 6 months using stabilizer (1%, v/v or w/v) such as LB broth (control), glycerol, skim milk, glycine, D-sorbitol and gelatin, and the phage was stable at 25°C for 6 months. Biofilm reduction was also observed by the phage (108 pfu ml^(-1)) infection in dose-dependent manner against E. aerogenes K113 upto 60%.
For the comparative genomics, whole genome sequence of the phage was analyzed using bioinformatic tools to study its genome and similarity of structural genes with closely related phages. F20 genome found similar to T1, TLS and RTP phages which was confirmed by molecular phylogeny and dot-plot analysis. Despite the high coverage of genome sequence similarities, it yielded comparable differences in the similarity of genes. Unexpectedly, 34.9% (n = 29) structural genes exhibited no similarity when compared to the other phages.
For the human clinical trial, the phage was studied for its interaction with human blood cells in vitro to demonstrate its safe therapeutic applications. Phage adsorption to human whole blood cells was achieved by 50% after 3 h of incubation and there was no further adsorption upto 6 h. Under the stepwise treatment with host bacteria and the phage to human blood, the phage lysed only host bacterial cells without causing any side effect to red blood cells which proven the safety assurance of its better clinical efficacy. Further, human polymorphonuclear leukocytes (PMNs) were subjected to evaluate the concentration of reactive oxygen species (ROS) production after triggering with Gram-negative bacterial lipopolysaccharides (LPS). The phage (10^(9) pfu ml^(-1)) inhibited the production of ROS caused by LPS of E. aerogenes K113 upto 50%. It did not decrease the ROS formation triggered by LPSs from different non-host strains such as E. coli ATCC 10536, E. coli ATCC 8739 and E. coli:0157 KCTC 14034. Melatonin (a positive control) reduced the ROS production by 20% at the concentration of 250 mM against commercially available LPS (Sigma, USA) of E. coli B. These data indicated important practical implications suggesting that the phage, when used in massive infections such as sepsis where ROS production is associated with tissue and organ damage, may eliminate harmful effects of endotoxin released after the bacterial infection.
These findings concluded that the phage F20 have great potentials and can be applied as a therapeutic agent for the phage therapy against human-infectious drug-resistant E. aerogenes. It can also control the excess production of ROS in human PMNs triggered by LPS. Comparative genomics of phage F20 provided valuable informations for the applications such as phage therapy, phage display and so on.
The aim of this study was to investigate a bacteriophage for its therapeutic approach against human-infectious and drug-resistant bacterial pathogens of Enterobacter species. In this study, a lytic phage was isolated from a lake near Daegu University, Gyoungsan city, Republic of Korea, to target human-infectious bacterial pathogens.
A bacterium named K113 was isolated, and subjected to biochemical characterization and drug-resistance determination using Walk Away Analyzer at the Hospital of Kyoungpook National University, Daegu city, Republic of Korea. The K113 exhibited biochemical characteristics of Enterobacteriaceae family such as Gram-negative and rod shaped bacterium, formation of large mucoid colonies of pink to purple on eosin methylene blue agar, oxi-ferment/enterotube positive, and oxidase and indole negative. Moreover, it was positive for glucose, raffinose, inositol, lysine, citrate, succinate, rahmnose, adonitol, arginine, esculin, maltose, nitrate, tartrate, sorbitol, arabinose, melibiose, ornithine, Voges Proskauer and o-nitrate phosphoglutarate test. On the other hand, it was negative for urea, phenylalanine, acetate, hydrogen sulphide and cetrizine. Importantly, it was resistant to the antibiotics such as Ampicilin (>16 µg ml^(-1)), Cefazolin (>16 µg ml^(-1)) and Vancomycin (>200 µg ml^(-1)). Molecular characterization of K113 by 16S rRNA gene sequencing exhibited 100% similarity to E. aerogenes. Hence, it was identified as Enterobacter aerogenes K113.
Lytic phage isolation was targeted against E. aerogenes K113 strain and a noble phage, named F20, was successfully isolated. This phage resulted in a good infection to the host K113 by showing the big size plaques (2–3 mm in diameter). The phage exhibited host specificity by lysing only two of the strains of Enterobactereaceae family (E. aerogenes K113 and E. aerogenes ATCC 13048) among the thirty-three tested strains; Acinetobacter baumannii, Bacillus subtilis, B. cereus, E. aerogenes, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeroginosa, Salmonella enteritidis, S. typhimurium and Staphylococcus aureus. Morphological analysis of the phage by transmission electron microscopy (TEM) revealed that it had an isometric head (50 ηm in diameter) and a long tail (150 ηm long and 10 ηm wide). Restriction enzyme analysis revealed that F20 was a linear dsDNA phage. Molecular characterization of the phage was conducted by sequencing of its whole genome that comprised 51,543 bp with total GC content of 47.9%. On the basis of the results obtained from TEM, restriction enzyme analysis and whole genome sequencing, F20 was identified as a T1 like phage under the Siphoviridae family of viruses.
In addition, other parameters of the phage were also studied for its multiplicity of infection (MOI), stability at different pH, temperatures, chemicals and ultraviolet (UV) radiation, and biofilm inhibition. The MOI was found to be 1:10 of phage particle per host cells. Phage F20 was stable at pH from 4 to 11, and resistant to chemicals such as chloroform and ethanol (10%, v/v) for upto 2 h at room temperature. It was highly sensitive to UV radiation (254 ηm) and killed within 40 sec, completely. The phage showed high thermal stability at temperature between 25 to 70°C with no significant reduction in titer upto 150 min. Long term stability was conducted for 6 months using stabilizer (1%, v/v or w/v) such as LB broth (control), glycerol, skim milk, glycine, D-sorbitol and gelatin, and the phage was stable at 25°C for 6 months. Biofilm reduction was also observed by the phage (108 pfu ml^(-1)) infection in dose-dependent manner against E. aerogenes K113 upto 60%.
For the comparative genomics, whole genome sequence of the phage was analyzed using bioinformatic tools to study its genome and similarity of structural genes with closely related phages. F20 genome found similar to T1, TLS and RTP phages which was confirmed by molecular phylogeny and dot-plot analysis. Despite the high coverage of genome sequence similarities, it yielded comparable differences in the similarity of genes. Unexpectedly, 34.9% (n = 29) structural genes exhibited no similarity when compared to the other phages.
For the human clinical trial, the phage was studied for its interaction with human blood cells in vitro to demonstrate its safe therapeutic applications. Phage adsorption to human whole blood cells was achieved by 50% after 3 h of incubation and there was no further adsorption upto 6 h. Under the stepwise treatment with host bacteria and the phage to human blood, the phage lysed only host bacterial cells without causing any side effect to red blood cells which proven the safety assurance of its better clinical efficacy. Further, human polymorphonuclear leukocytes (PMNs) were subjected to evaluate the concentration of reactive oxygen species (ROS) production after triggering with Gram-negative bacterial lipopolysaccharides (LPS). The phage (10^(9) pfu ml^(-1)) inhibited the production of ROS caused by LPS of E. aerogenes K113 upto 50%. It did not decrease the ROS formation triggered by LPSs from different non-host strains such as E. coli ATCC 10536, E. coli ATCC 8739 and E. coli:0157 KCTC 14034. Melatonin (a positive control) reduced the ROS production by 20% at the concentration of 250 mM against commercially available LPS (Sigma, USA) of E. coli B. These data indicated important practical implications suggesting that the phage, when used in massive infections such as sepsis where ROS production is associated with tissue and organ damage, may eliminate harmful effects of endotoxin released after the bacterial infection.
These findings concluded that the phage F20 have great potentials and can be applied as a therapeutic agent for the phage therapy against human-infectious drug-resistant E. aerogenes. It can also control the excess production of ROS in human PMNs triggered by LPS. Comparative genomics of phage F20 provided valuable informations for the applications such as phage therapy, phage display and so on.
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