벼 인산 신호 전달 유전자의 기능 분석과 유용아미노산 고함유 기능성 벼의 육종 : Molecular Characterization of Rice Phosphate Signaling Genes and Molecular Breeding of Glycine and Alanine-Rich Rices원문보기
벼는 동남아시아, 라틴아메리카 등지에서 주요 식량자원으로 이용되고 있으며 게놈 서열이 모두 밝혀져 있어 단자엽 식물의 연구 모델 작물로 널리 이용되고 있다. 토양 내의 인산은 식물이 이용하기 어려운 형태로 존재하고 있어 많은 양의 비료를 첨가하더라도 실제 식물이 이용할 수 있는 양은 매우 적다. 본 연구는 벼 식물체의 인산 결핍시 뿌리 특이적으로 유도되어 인산 ...
벼는 동남아시아, 라틴아메리카 등지에서 주요 식량자원으로 이용되고 있으며 게놈 서열이 모두 밝혀져 있어 단자엽 식물의 연구 모델 작물로 널리 이용되고 있다. 토양 내의 인산은 식물이 이용하기 어려운 형태로 존재하고 있어 많은 양의 비료를 첨가하더라도 실제 식물이 이용할 수 있는 양은 매우 적다. 본 연구는 벼 식물체의 인산 결핍시 뿌리 특이적으로 유도되어 인산 신호전달 경로에서 하류 유전자의 발현을 조절할 것으로 예상되는 OsUPS, OsMAPK3 유전자와 산왕거미로부터 분리한 AvDrag 유전자를 벼에 형질전환하여 기능을 분석하였다. OsUPS 유전자는 다른 식물 유전자들과 52% 정도의 유사도를 보이고, U-box domain과 GKL domain을 가지고 있다. OsUPS 유전자는 인산결핍 처리 후 30분부터 강한 발현을 보이고, 철 결핍 처리 후 4시간째에 가장 강한 발현을 보였다. OsUPS 재조합 단백질을 이용하여 ubiquitination assay를 수행한 결과, E1, E2와 OsUPS 단백질이 모두 존재하는 조건에서 ubiquitination 된 단백질 밴드를 확인할 수 있었다. OsUPS mutant 식물체는 유전자의 promoter 영역에 T-DNA가 삽입되어 있는 것으로 나타났다. WT, 과발현 식물체와 mutant를 인산이 충분 혹은 결핍된 영양액에서 키운 뒤 인산 함량을 측정하였다. WT 식물체에 비해 과발현 식물체는 인산 함량이 10% 정도 낮았고, mutant 식물체는 인산함량이 40% 정도 높게 나타났다. RT-PCR 수행 결과 과발현 식물체의 뿌리에서 OsSPX1, OsIPS1, OsPHO2가 발현 되는 것을 확인하였다. Real-time PCR 결과 OsPT1, 2, 3, 4 유전자가 mutant 식물체의 뿌리에서 과발현되는 것을 확인하였으며 이 유전자들의 발현이 mutant 식물체의 인산함량증가에 영향을 미친 것으로 예상된다. OsUPS 유전자의 promoter 부분을 분리하여 형질전환체의 GUS 발현을 확인한 결과 인산 결핍, salt 처리, 자스몬산 처리시 식물체의 측근과 뿌리털 부분으로 GUS 발현이 집중되었다. OsMAPK3 유전자는 다른 식물체의 MAP kinase 유전자와 70 % 이상의 상동성을 보였다. OsMAPK3는 인산과 철 결핍, 자스몬산 처리에서 강하게 발현하였다. OsMAPK3 단백질은 autophosphorylation하였고, substrate인 MBP를 인산화시켜 kinase activity를 가지는 것으로 나타났다. WT과 OsMAPK3 유전자 과발현 식물체를 인산 충분 혹은 결핍 조건의 영양액에서 키운 뒤 생육차이와 인산 함량을 측정하였다. 인산 함량은 WT에 비해 과발현 식물체가 30% 정도 높게 나타났다. OsMAPK3 유전자의 promoter 부위를 분리하여 형질전환체를 제작한 뒤 GUS 발현을 확인하였고 인산 결핍시 식물체의 뿌리와 뿌리털 부분에서 GUS 발현이 강하게 나타났다. Silk protein을 암호화하는 AvDrag 유전자의 C-terminal 부위를 종자 특이적으로 발현하는 prolamin promoter에 연결하여 construct를 제작한 뒤 벼에 형질전환시켰다. 얻어진 T0 식물체를 PCR, Northern, Western blot을 통해 선발하였다. 형질전환된 벼 종자를 출수 후 10일 간격으로 샘플링하여 Northern과 Western blot을 수행한 결과 종자가 성숙될수록 유전자와 단백질 발현이 강하게 나타나는 것을 확인하였다. 종자의 아미노산 함량을 측정한 결과 alanine, glycine, serine, glutamic acid의 함량이 30~50% 정도 증가한 것으로 나타났다. 쥐의 성장률, 지질대사 및 간 기능 개선에 미치는 형질전환 벼의 효과를 조사한 결과, 간기능, 지질대사 및 당질대사의 개선효과가 있는 것으로 나타났다.
벼는 동남아시아, 라틴아메리카 등지에서 주요 식량자원으로 이용되고 있으며 게놈 서열이 모두 밝혀져 있어 단자엽 식물의 연구 모델 작물로 널리 이용되고 있다. 토양 내의 인산은 식물이 이용하기 어려운 형태로 존재하고 있어 많은 양의 비료를 첨가하더라도 실제 식물이 이용할 수 있는 양은 매우 적다. 본 연구는 벼 식물체의 인산 결핍시 뿌리 특이적으로 유도되어 인산 신호전달 경로에서 하류 유전자의 발현을 조절할 것으로 예상되는 OsUPS, OsMAPK3 유전자와 산왕거미로부터 분리한 AvDrag 유전자를 벼에 형질전환하여 기능을 분석하였다. OsUPS 유전자는 다른 식물 유전자들과 52% 정도의 유사도를 보이고, U-box domain과 GKL domain을 가지고 있다. OsUPS 유전자는 인산결핍 처리 후 30분부터 강한 발현을 보이고, 철 결핍 처리 후 4시간째에 가장 강한 발현을 보였다. OsUPS 재조합 단백질을 이용하여 ubiquitination assay를 수행한 결과, E1, E2와 OsUPS 단백질이 모두 존재하는 조건에서 ubiquitination 된 단백질 밴드를 확인할 수 있었다. OsUPS mutant 식물체는 유전자의 promoter 영역에 T-DNA가 삽입되어 있는 것으로 나타났다. WT, 과발현 식물체와 mutant를 인산이 충분 혹은 결핍된 영양액에서 키운 뒤 인산 함량을 측정하였다. WT 식물체에 비해 과발현 식물체는 인산 함량이 10% 정도 낮았고, mutant 식물체는 인산함량이 40% 정도 높게 나타났다. RT-PCR 수행 결과 과발현 식물체의 뿌리에서 OsSPX1, OsIPS1, OsPHO2가 발현 되는 것을 확인하였다. Real-time PCR 결과 OsPT1, 2, 3, 4 유전자가 mutant 식물체의 뿌리에서 과발현되는 것을 확인하였으며 이 유전자들의 발현이 mutant 식물체의 인산함량증가에 영향을 미친 것으로 예상된다. OsUPS 유전자의 promoter 부분을 분리하여 형질전환체의 GUS 발현을 확인한 결과 인산 결핍, salt 처리, 자스몬산 처리시 식물체의 측근과 뿌리털 부분으로 GUS 발현이 집중되었다. OsMAPK3 유전자는 다른 식물체의 MAP kinase 유전자와 70 % 이상의 상동성을 보였다. OsMAPK3는 인산과 철 결핍, 자스몬산 처리에서 강하게 발현하였다. OsMAPK3 단백질은 autophosphorylation하였고, substrate인 MBP를 인산화시켜 kinase activity를 가지는 것으로 나타났다. WT과 OsMAPK3 유전자 과발현 식물체를 인산 충분 혹은 결핍 조건의 영양액에서 키운 뒤 생육차이와 인산 함량을 측정하였다. 인산 함량은 WT에 비해 과발현 식물체가 30% 정도 높게 나타났다. OsMAPK3 유전자의 promoter 부위를 분리하여 형질전환체를 제작한 뒤 GUS 발현을 확인하였고 인산 결핍시 식물체의 뿌리와 뿌리털 부분에서 GUS 발현이 강하게 나타났다. Silk protein을 암호화하는 AvDrag 유전자의 C-terminal 부위를 종자 특이적으로 발현하는 prolamin promoter에 연결하여 construct를 제작한 뒤 벼에 형질전환시켰다. 얻어진 T0 식물체를 PCR, Northern, Western blot을 통해 선발하였다. 형질전환된 벼 종자를 출수 후 10일 간격으로 샘플링하여 Northern과 Western blot을 수행한 결과 종자가 성숙될수록 유전자와 단백질 발현이 강하게 나타나는 것을 확인하였다. 종자의 아미노산 함량을 측정한 결과 alanine, glycine, serine, glutamic acid의 함량이 30~50% 정도 증가한 것으로 나타났다. 쥐의 성장률, 지질대사 및 간 기능 개선에 미치는 형질전환 벼의 효과를 조사한 결과, 간기능, 지질대사 및 당질대사의 개선효과가 있는 것으로 나타났다.
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