최근 고령화 사회가 진행됨에 따라 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환치료에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 신경퇴행성 질환의 치료를 위해 줄기세포 치 료 대 체 법 의 일환으로 광유전자 기법에 대해 소개하였다. 이는 광유전자를 줄기세포에 도입함으로써 기존 전기적인 자극을 이 용 해 세포를 활 성 화 시 키 는 기존의 방식에 비해 보다 cell-specificity를 향상 시 켜 원하는 세포만을 자극할 수 있는 장점을 가진 다 . 현재 ...
최근 고령화 사회가 진행됨에 따라 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환치료에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 신경퇴행성 질환의 치료를 위해 줄기세포 치 료 대 체 법 의 일환으로 광유전자 기법에 대해 소개하였다. 이는 광유전자를 줄기세포에 도입함으로써 기존 전기적인 자극을 이 용 해 세포를 활 성 화 시 키 는 기존의 방식에 비해 보다 cell-specificity를 향상 시 켜 원하는 세포만을 자극할 수 있는 장점을 가진 다 . 현재 배아줄기세포를 이용한 광유전자 기법과 달리 우리는 성 체 줄 기 세 포 인 사랑니에서 유래한 치 아 줄 기 세 포 를 이용한 광유전자 도입형 신경줄기세포를 제작함으로써, 세포 이용 접근성이 용이하며 자가이식이 가능한 장점을 가 지도 록 하였다. 이러한 줄기세포는 세포면역화학염색 법 과 FACS, DNA microarray를 통해 미분화된 신경줄기세포가 가 지 는 구조적인 특성을 나타냄을 확인하였다. 미성숙한 신경줄기세포의 특 성 을 나타내는 PS-NCAM protein의 구조를 가진 세포만을 분리해냄으로써 신경세포로의 분화능을 증가시켰고, 분리된 세포는 CD133, Sox2, Nestin 등 신경줄기세포의 특 성 을 지니는 protein의 발현이 강하 게 보이며, 이를 사이토카인, 성장인자 등과 같은 외부 화학물질에 의해 신 경 세 포로 의 분화를 유도 하 였 다 . 이는 세포면역화학염색법과 RT-PCR로 분석한 결과, 분화가 유도된 세포는 형태학적, 구 조 적 으 로 신경세포가 가 지 는 특성을 나 타 내 긴 했으나, 유의한 차이를 보 이 지 는 않았으며, 이는 완전히 성숙한 신경세포라고 보기는 어려우며 여전히 줄기세포의 성격을 가지고 있는 것으로 판단되었다. 이는 patch-clamp recording system을 이용해 신경세포의 기능성 평가를 수행해본 결 과 , 신경세포가 가지는 활성 전위, 즉 action potential이 발생하지 않음을 확인함으로써 분 화 가 유도된 치아유래신경줄기세포가 형태학적, 구조적으로 신 경 세 포 의 특성을 가지지만, 기 능 학 적 으 로 는 신경세포로 분화되지 않았음을 확인하였다. 우리는 이러한 치 아 줄 기 세 포 에 광 유 전 자 인 채널로돕신 2 유전자를 렌티바이러스를 이용해 도입한 후 형 광 현미 경 으 로 관찰한 결과, 광자극에 의해 세포막에 위 치 한 채널로돕신2 광 유 전 자 가 양 이 온 채 널 이 개폐를 유도하여 세포외부에 존재하던 Na+ 이온을 세포내로 흘 려 보 냄 으 로 써 발생하는 inward current를 확인하였다. 따라서 채널로돕신2 광유전자는 치아줄기세포에 잘 적용됨을 확인할 수 있었고, 좀더 cell-type specificity를 향 상시 키 기 위해 신경세포 타겟 promoter (CaMKIIa promoter)를 이용한 광유전자를 동일한 방법으로 치 아 줄 기 세 포 에 도입한 후 세 포 면 역 화 학 염 색 법 으 로 관찰한 결과 CaMKIIa protein이 잘 발현되었으며 이를 컨포칼 마이크로 스 코 프 를 이용해 3D image로 확인한 결과, 광유전자가 세포에 도입되긴 했으나 세포막에 위치하지 않고 세포질에 산재되어 있음을 확인하였다. 따라서 광자극에 의한 inward current 역시 관찰할 수 없었다. 하지만 신경세포에 타겟되는 CaMKIIa promoter를 가진 광유 전 자 가 도입되는 것으로 보아 도입된 광유전자가 분화된 치아줄기세포의 action potential 생성을 유도시킬 것이라 기대한다. 이러한 치아줄기세포는 신경세포로의 분화가능성을 지니고 있는 cell source일 뿐만 아니라 광자극에 의해 activity를 조절할 수 있음을 확인하였다. 따라서 광유전자 도입형 치아줄기세포를 이 용 해 synaptic activity, plasticity와 같은 neural processing을 조 절 함 으 로써 stem cell based-optogenetics가 퇴행성신경질환을 치료하기 위한 유용한 tool이 될 수 있을 것으로 기대한다.
최근 고령화 사회가 진행됨에 따라 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환치료에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 신경퇴행성 질환의 치료를 위해 줄기세포 치 료 대 체 법 의 일환으로 광유전자 기법에 대해 소개하였다. 이는 광유전자를 줄기세포에 도입함으로써 기존 전기적인 자극을 이 용 해 세포를 활 성 화 시 키 는 기존의 방식에 비해 보다 cell-specificity를 향상 시 켜 원하는 세포만을 자극할 수 있는 장점을 가진 다 . 현재 배아줄기세포를 이용한 광유전자 기법과 달리 우리는 성 체 줄 기 세 포 인 사랑니에서 유래한 치 아 줄 기 세 포 를 이용한 광유전자 도입형 신경줄기세포를 제작함으로써, 세포 이용 접근성이 용이하며 자가이식이 가능한 장점을 가 지도 록 하였다. 이러한 줄기세포는 세포면역화학염색 법 과 FACS, DNA microarray를 통해 미분화된 신경줄기세포가 가 지 는 구조적인 특성을 나타냄을 확인하였다. 미성숙한 신경줄기세포의 특 성 을 나타내는 PS-NCAM protein의 구조를 가진 세포만을 분리해냄으로써 신경세포로의 분화능을 증가시켰고, 분리된 세포는 CD133, Sox2, Nestin 등 신경줄기세포의 특 성 을 지니는 protein의 발현이 강하 게 보이며, 이를 사이토카인, 성장인자 등과 같은 외부 화학물질에 의해 신 경 세 포로 의 분화를 유도 하 였 다 . 이는 세포면역화학염색법과 RT-PCR로 분석한 결과, 분화가 유도된 세포는 형태학적, 구 조 적 으 로 신경세포가 가 지 는 특성을 나 타 내 긴 했으나, 유의한 차이를 보 이 지 는 않았으며, 이는 완전히 성숙한 신경세포라고 보기는 어려우며 여전히 줄기세포의 성격을 가지고 있는 것으로 판단되었다. 이는 patch-clamp recording system을 이용해 신경세포의 기능성 평가를 수행해본 결 과 , 신경세포가 가지는 활성 전위, 즉 action potential이 발생하지 않음을 확인함으로써 분 화 가 유도된 치아유래신경줄기세포가 형태학적, 구조적으로 신 경 세 포 의 특성을 가지지만, 기 능 학 적 으 로 는 신경세포로 분화되지 않았음을 확인하였다. 우리는 이러한 치 아 줄 기 세 포 에 광 유 전 자 인 채널로돕신 2 유전자를 렌티바이러스를 이용해 도입한 후 형 광 현미 경 으 로 관찰한 결과, 광자극에 의해 세포막에 위 치 한 채널로돕신2 광 유 전 자 가 양 이 온 채 널 이 개폐를 유도하여 세포외부에 존재하던 Na+ 이온을 세포내로 흘 려 보 냄 으 로 써 발생하는 inward current를 확인하였다. 따라서 채널로돕신2 광유전자는 치아줄기세포에 잘 적용됨을 확인할 수 있었고, 좀더 cell-type specificity를 향 상시 키 기 위해 신경세포 타겟 promoter (CaMKIIa promoter)를 이용한 광유전자를 동일한 방법으로 치 아 줄 기 세 포 에 도입한 후 세 포 면 역 화 학 염 색 법 으 로 관찰한 결과 CaMKIIa protein이 잘 발현되었으며 이를 컨포칼 마이크로 스 코 프 를 이용해 3D image로 확인한 결과, 광유전자가 세포에 도입되긴 했으나 세포막에 위치하지 않고 세포질에 산재되어 있음을 확인하였다. 따라서 광자극에 의한 inward current 역시 관찰할 수 없었다. 하지만 신경세포에 타겟되는 CaMKIIa promoter를 가진 광유 전 자 가 도입되는 것으로 보아 도입된 광유전자가 분화된 치아줄기세포의 action potential 생성을 유도시킬 것이라 기대한다. 이러한 치아줄기세포는 신경세포로의 분화가능성을 지니고 있는 cell source일 뿐만 아니라 광자극에 의해 activity를 조절할 수 있음을 확인하였다. 따라서 광유전자 도입형 치아줄기세포를 이 용 해 synaptic activity, plasticity와 같은 neural processing을 조 절 함 으 로써 stem cell based-optogenetics가 퇴행성신경질환을 치료하기 위한 유용한 tool이 될 수 있을 것으로 기대한다.
Recent studies introduced the stem-cell based-optogenetic methods for replacement following neurodegeneration. Here, we have intended to create the optogenetic tool using channelrhodopsin-2 (ChR2) gene in PS-NCAM+ human dental papilla tissue-derived neural stem cells (hDPNSCs) to restore function of...
Recent studies introduced the stem-cell based-optogenetic methods for replacement following neurodegeneration. Here, we have intended to create the optogenetic tool using channelrhodopsin-2 (ChR2) gene in PS-NCAM+ human dental papilla tissue-derived neural stem cells (hDPNSCs) to restore function of damaged tissues. The PS-NCAM+ hDPNSCs were isolated from dental papilla tissue and expressed markers for neural stem cells, such as CD133, Sox2 and Nestin. Also, the differentiated PS-NCAM+ hDPNSCs under restricted condition had the neural morphology and it expressed several neural proteins like MAP2 and NF. Furthermore, we transduced the lentiviral-ChR2-YFP transgene into the PS-NCAM+ hDPNSCs. The ChR2 trafficked to the membrane well in the PS-NCAM+ hDPNSCs and represented inward current of the cell membrane by photostimulation. Our research suggested that the PS-NCAM+ hDPNSCs were capable of alternating neurons malfunctioned as a therapeutic source. And by neural process using light, we proposed that it is allowed to be a useful tool to neuroscientists and bioengineers.
Recent studies introduced the stem-cell based-optogenetic methods for replacement following neurodegeneration. Here, we have intended to create the optogenetic tool using channelrhodopsin-2 (ChR2) gene in PS-NCAM+ human dental papilla tissue-derived neural stem cells (hDPNSCs) to restore function of damaged tissues. The PS-NCAM+ hDPNSCs were isolated from dental papilla tissue and expressed markers for neural stem cells, such as CD133, Sox2 and Nestin. Also, the differentiated PS-NCAM+ hDPNSCs under restricted condition had the neural morphology and it expressed several neural proteins like MAP2 and NF. Furthermore, we transduced the lentiviral-ChR2-YFP transgene into the PS-NCAM+ hDPNSCs. The ChR2 trafficked to the membrane well in the PS-NCAM+ hDPNSCs and represented inward current of the cell membrane by photostimulation. Our research suggested that the PS-NCAM+ hDPNSCs were capable of alternating neurons malfunctioned as a therapeutic source. And by neural process using light, we proposed that it is allowed to be a useful tool to neuroscientists and bioengineers.
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