[학위논문]Protease IV 결핍, 아실기전이효소 발현, 성장억제가 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 병독성에 미치는 영향 Effects of Protease IV knock-out, acyltransferase overexpression, and growth restriction on virulence of Pseudomonas aeruginosa원문보기
녹농균은 다양한 환경에 존재하며, 식물, 곤충, 선충, 사람 등과 같은 여러 숙주에 감염을 일으키는 병원균이다. 녹농균의 많은 병독 인자 중, Protease IV 는 세균성각막염과 같은 녹농균 감염에 관여하는 것으로 제안되어 왔다. 이전 연구들에서 Protease IV가 곤충에게 중요한 병독인자라는 것이 제안된 바 있지만, 이에 대한 결정적인 증거는 부족하였다. 본 연구에서는 Protease IV가 결핍된 돌연변이를 제조하여, 이 돌연변이가 곤충의 일종인 Tenebrio molitor에 대한 녹농균의 병독성을 완화시킴을 확인함으로써 이를 입증하였다. 또한 Protease IV 결핍 돌연변이가 선충의 일종인 Caenorhabditis elegans에 대한 병독성을 완화시키지 않음을 발견하여, Protease IV에 의한 병독성이 곤충에게서만 특이적으로 나타남을 제시하였다. 녹농균의 많은 다른 병독인자들처럼 Protease IV도 쿼럼 센싱 (quorum sensing; ...
녹농균은 다양한 환경에 존재하며, 식물, 곤충, 선충, 사람 등과 같은 여러 숙주에 감염을 일으키는 병원균이다. 녹농균의 많은 병독 인자 중, Protease IV 는 세균성각막염과 같은 녹농균 감염에 관여하는 것으로 제안되어 왔다. 이전 연구들에서 Protease IV가 곤충에게 중요한 병독인자라는 것이 제안된 바 있지만, 이에 대한 결정적인 증거는 부족하였다. 본 연구에서는 Protease IV가 결핍된 돌연변이를 제조하여, 이 돌연변이가 곤충의 일종인 Tenebrio molitor에 대한 녹농균의 병독성을 완화시킴을 확인함으로써 이를 입증하였다. 또한 Protease IV 결핍 돌연변이가 선충의 일종인 Caenorhabditis elegans에 대한 병독성을 완화시키지 않음을 발견하여, Protease IV에 의한 병독성이 곤충에게서만 특이적으로 나타남을 제시하였다. 녹농균의 많은 다른 병독인자들처럼 Protease IV도 쿼럼 센싱 (quorum sensing; QS) 기전의 조절에 의해 세포밀도에 의존적으로 발현된다. 녹농균의 병독성을 제어하기 위해, 아실기전이효소(acyltransferase)들을 과량발현시킴으로써 QS을 조절하고자 하였다. 이를 위해, 7개의 아실기전이효소 유전자를 클로닝하여 이를 과량발현시킨 후 녹농균의 QS 조절과 병독성에 미치는 영향을 조사하였다. 일부 아실기전이효소들은 QS 조절과 병원성, 운동성, 생물막 형성 등과 같은 QS와 연관된 표현형에 영향을 끼쳤으며, 일부는 과량발현되었을 때 심한 성장저해를 초래하였다. 특히, 아실기전이효소 추정 유전자 중 하나인 PA2537의 과다발현은 QscR 활성을 증가시킬 뿐만 아니라, 녹농균의 성장 또한 강하게 억제시켰다. 이러한 QS 반응의 변화가 PA2537의 과다발현과 그로 인한 성장억제 중 어느 요인에 의해 일어난 것인지 조사하여, 성장억제가 QscR의 활성을 증가시켰음을 발견하였다. 흥미롭게도 다른 QS 수용체인 LasR 과 PqsR의 활성은 성장억제에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나 산화환원 조절 단백질인 SoxR과 anthranilate 대사과정의 조절 단백질인 AntR 등 QS 수용체가 아닌 일부 조절 단백질들은 성장이 억제된 환경에서 활성이 증가하였다. 성장 억제에 의해 이런 수용체들의 활성이 왜 증가하는지는 확실하지 않지만, 본 연구 결과는 산화적 스트레스는 아마도 그 원인이 아님을 보여준다.
녹농균은 다양한 환경에 존재하며, 식물, 곤충, 선충, 사람 등과 같은 여러 숙주에 감염을 일으키는 병원균이다. 녹농균의 많은 병독 인자 중, Protease IV 는 세균성각막염과 같은 녹농균 감염에 관여하는 것으로 제안되어 왔다. 이전 연구들에서 Protease IV가 곤충에게 중요한 병독인자라는 것이 제안된 바 있지만, 이에 대한 결정적인 증거는 부족하였다. 본 연구에서는 Protease IV가 결핍된 돌연변이를 제조하여, 이 돌연변이가 곤충의 일종인 Tenebrio molitor에 대한 녹농균의 병독성을 완화시킴을 확인함으로써 이를 입증하였다. 또한 Protease IV 결핍 돌연변이가 선충의 일종인 Caenorhabditis elegans에 대한 병독성을 완화시키지 않음을 발견하여, Protease IV에 의한 병독성이 곤충에게서만 특이적으로 나타남을 제시하였다. 녹농균의 많은 다른 병독인자들처럼 Protease IV도 쿼럼 센싱 (quorum sensing; QS) 기전의 조절에 의해 세포밀도에 의존적으로 발현된다. 녹농균의 병독성을 제어하기 위해, 아실기전이효소(acyltransferase)들을 과량발현시킴으로써 QS을 조절하고자 하였다. 이를 위해, 7개의 아실기전이효소 유전자를 클로닝하여 이를 과량발현시킨 후 녹농균의 QS 조절과 병독성에 미치는 영향을 조사하였다. 일부 아실기전이효소들은 QS 조절과 병원성, 운동성, 생물막 형성 등과 같은 QS와 연관된 표현형에 영향을 끼쳤으며, 일부는 과량발현되었을 때 심한 성장저해를 초래하였다. 특히, 아실기전이효소 추정 유전자 중 하나인 PA2537의 과다발현은 QscR 활성을 증가시킬 뿐만 아니라, 녹농균의 성장 또한 강하게 억제시켰다. 이러한 QS 반응의 변화가 PA2537의 과다발현과 그로 인한 성장억제 중 어느 요인에 의해 일어난 것인지 조사하여, 성장억제가 QscR의 활성을 증가시켰음을 발견하였다. 흥미롭게도 다른 QS 수용체인 LasR 과 PqsR의 활성은 성장억제에 의해 영향을 받지 않았다. 그러나 산화환원 조절 단백질인 SoxR과 anthranilate 대사과정의 조절 단백질인 AntR 등 QS 수용체가 아닌 일부 조절 단백질들은 성장이 억제된 환경에서 활성이 증가하였다. 성장 억제에 의해 이런 수용체들의 활성이 왜 증가하는지는 확실하지 않지만, 본 연구 결과는 산화적 스트레스는 아마도 그 원인이 아님을 보여준다.
Pseudomonas aeruginosa is an ubiquitous multi-host pathogen infectious to plants, insects, nematodes, human, and so on. Among many virulence factors of P. aeruginosa, Protease IV has been suggested to be involved in some Pseudomonas infections such as corneal infection. While previous studies of our...
Pseudomonas aeruginosa is an ubiquitous multi-host pathogen infectious to plants, insects, nematodes, human, and so on. Among many virulence factors of P. aeruginosa, Protease IV has been suggested to be involved in some Pseudomonas infections such as corneal infection. While previous studies of our laboratory suggested that Protease IV might be a key virulence factor against insect, a crucial evidence for this suggestion lacked. In this study, I constructed a Protease IV-deficient mutant and confirmed the attenuated virulence of the mutant to Tenebrio molitor, an insect, validating the suggestion. I also found that the virulence of P. aeruginosa to other host, Caenorhabditis elegans, a nematode, was not attenuated by the Protease IV mutation, suggesting that the Protease IV-mediated virulence is specific to insect. Like many other virulence factors of P. aeruginosa, Protease IV is expressed in a cell density-dependent manner under the control of quorum sensing (QS) regulation. In order to control the virulence of P. aeruginosa, I would modulate QS system by overexpressing acyltransferases. For this, I cloned 7 acyltransferase genes and overexpressed them to investigate the effect on the QS regulation and virulence of P. aeruginosa. While some acyltransferases affected the QS regulation, virulence, and some QS-related phenotypes, such as motility and biofilm formation, they also caused serious growth retardation when overexpressed. Especially, the overexpression of a putative acyltransferase gene, PA2537 strongly inhibited the growth of P. aeruginosa, as well as it significantly increased the activity of QscR. I investigated which of the overexpression of PA2537 or the resulting growth restriction modulated the QS response and found that the growth restriction activated the QscR activity. Interestingly, LasR and PqsR, other QS regulators were not affected by the growth restriction. However, some non-QS regulators such as SoxR, a redox regulator and AntR, a regulator in anthranilate metabolism were activated in the growth restricted condition. It is not clear why these regulators were activated by growth restriction, but my result demonstrated that the oxidative stress might not the cause.
Pseudomonas aeruginosa is an ubiquitous multi-host pathogen infectious to plants, insects, nematodes, human, and so on. Among many virulence factors of P. aeruginosa, Protease IV has been suggested to be involved in some Pseudomonas infections such as corneal infection. While previous studies of our laboratory suggested that Protease IV might be a key virulence factor against insect, a crucial evidence for this suggestion lacked. In this study, I constructed a Protease IV-deficient mutant and confirmed the attenuated virulence of the mutant to Tenebrio molitor, an insect, validating the suggestion. I also found that the virulence of P. aeruginosa to other host, Caenorhabditis elegans, a nematode, was not attenuated by the Protease IV mutation, suggesting that the Protease IV-mediated virulence is specific to insect. Like many other virulence factors of P. aeruginosa, Protease IV is expressed in a cell density-dependent manner under the control of quorum sensing (QS) regulation. In order to control the virulence of P. aeruginosa, I would modulate QS system by overexpressing acyltransferases. For this, I cloned 7 acyltransferase genes and overexpressed them to investigate the effect on the QS regulation and virulence of P. aeruginosa. While some acyltransferases affected the QS regulation, virulence, and some QS-related phenotypes, such as motility and biofilm formation, they also caused serious growth retardation when overexpressed. Especially, the overexpression of a putative acyltransferase gene, PA2537 strongly inhibited the growth of P. aeruginosa, as well as it significantly increased the activity of QscR. I investigated which of the overexpression of PA2537 or the resulting growth restriction modulated the QS response and found that the growth restriction activated the QscR activity. Interestingly, LasR and PqsR, other QS regulators were not affected by the growth restriction. However, some non-QS regulators such as SoxR, a redox regulator and AntR, a regulator in anthranilate metabolism were activated in the growth restricted condition. It is not clear why these regulators were activated by growth restriction, but my result demonstrated that the oxidative stress might not the cause.
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