[학위논문]녹농균(Pseudomonas aeruginosa)이 형성하는 생물막의 계층 구조에 따른 유전자들의 차등 조절 Differential Regulation of Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilm Depending on Spatial Structure원문보기
생물막은 미생물들이 세포 외부로 스스로 분비한 다량체 기질 속에 형성되는 조직화된 공동체이다. 생물막의 형성은 미생물에게 가혹한 환경으로부터의 보호나, 물질 대사상의 협력, 생존과 적응을 위한 유전정보 교환과 같은 많은 유리함을 준다. 본 연구에서는 세포의 산화적 스트레스, ...
생물막은 미생물들이 세포 외부로 스스로 분비한 다량체 기질 속에 형성되는 조직화된 공동체이다. 생물막의 형성은 미생물에게 가혹한 환경으로부터의 보호나, 물질 대사상의 협력, 생존과 적응을 위한 유전정보 교환과 같은 많은 유리함을 준다. 본 연구에서는 세포의 산화적 스트레스, 이차 대사산물 생산, 세포 내부와 세포간의 신호전달과 관련 되어있는 유전자들의 발현을 생물막 내부 계층 분포에 따라 조사하였다. 본 실험에는 생물막과 세포간 신호전달 연구의 대표적 모델 균주인 녹농균의 생물막이 이용되었다. 물리적 분획 방법을 이용하여 생물막 표면으로부터의 깊이에 따라 생물막을 여러 층으로 분획하였고, 산화적 스트레스 반응 유전자, anthranilate 대사 유전자, Pseudomonas quinolone signal (PQS) 합성 유전자, 쿼럼 센싱 관련 유전자, 그리고 cyclc dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) 관련 유전자의 발현 정도를 생리현상을 대표하는 유전자로써 모니터링 하였다. 그 결과 생물막 내 서로 다른 계층에서 분획된 세포의 유전자들은 서로 다르게 발현됨을 확인하였다. 센서 또는 조절 단백질의 유전자 (soxR, oxyR, antR, lasR, rhlR, qscR, pqsR) 발현은 바깥쪽 층에서 가장 높고, 중간층에서 감소하다가 안쪽 층에서는 다시 약간 증가하였다. 그들의 표적 유전자 (PA2274, katB, antA, lasI, rhlI, PA1897, pqsA)들의 발현 패턴은 안쪽으로 갈수록 점점 감소하는 모양 이거나, 급격히 감소하다가 일정하게 유지되는 L자 형태를 보였다. 흥미롭게도, pelD 유전자 발현은 생물막 내부로 갈수록 서서히 증가 하였다. 한편, 생물막 내 서로 다른 계층의 세포들은 산화적 스트레스에 대해서 서로 다르게 반응하였는데, 이때 생물막 내부의 세포들은 자극에 대한 반응성이 없었다. 이러한 무반응성은 액체 배양에서 정체기에 있는 세포에서도 유사하게 관찰되었다. 본 연구의 결과는 유전적으로 동일한 세포가 형성시킨 생물막이라 할지라도, 생물막 구조 내부 세포들은 생리적으로 동일하지 않을 수 있음을 보여준다.
생물막은 미생물들이 세포 외부로 스스로 분비한 다량체 기질 속에 형성되는 조직화된 공동체이다. 생물막의 형성은 미생물에게 가혹한 환경으로부터의 보호나, 물질 대사상의 협력, 생존과 적응을 위한 유전정보 교환과 같은 많은 유리함을 준다. 본 연구에서는 세포의 산화적 스트레스, 이차 대사산물 생산, 세포 내부와 세포간의 신호전달과 관련 되어있는 유전자들의 발현을 생물막 내부 계층 분포에 따라 조사하였다. 본 실험에는 생물막과 세포간 신호전달 연구의 대표적 모델 균주인 녹농균의 생물막이 이용되었다. 물리적 분획 방법을 이용하여 생물막 표면으로부터의 깊이에 따라 생물막을 여러 층으로 분획하였고, 산화적 스트레스 반응 유전자, anthranilate 대사 유전자, Pseudomonas quinolone signal (PQS) 합성 유전자, 쿼럼 센싱 관련 유전자, 그리고 cyclc dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) 관련 유전자의 발현 정도를 생리현상을 대표하는 유전자로써 모니터링 하였다. 그 결과 생물막 내 서로 다른 계층에서 분획된 세포의 유전자들은 서로 다르게 발현됨을 확인하였다. 센서 또는 조절 단백질의 유전자 (soxR, oxyR, antR, lasR, rhlR, qscR, pqsR) 발현은 바깥쪽 층에서 가장 높고, 중간층에서 감소하다가 안쪽 층에서는 다시 약간 증가하였다. 그들의 표적 유전자 (PA2274, katB, antA, lasI, rhlI, PA1897, pqsA)들의 발현 패턴은 안쪽으로 갈수록 점점 감소하는 모양 이거나, 급격히 감소하다가 일정하게 유지되는 L자 형태를 보였다. 흥미롭게도, pelD 유전자 발현은 생물막 내부로 갈수록 서서히 증가 하였다. 한편, 생물막 내 서로 다른 계층의 세포들은 산화적 스트레스에 대해서 서로 다르게 반응하였는데, 이때 생물막 내부의 세포들은 자극에 대한 반응성이 없었다. 이러한 무반응성은 액체 배양에서 정체기에 있는 세포에서도 유사하게 관찰되었다. 본 연구의 결과는 유전적으로 동일한 세포가 형성시킨 생물막이라 할지라도, 생물막 구조 내부 세포들은 생리적으로 동일하지 않을 수 있음을 보여준다.
Biofilms are well organized cooperating communities of microorganisms which are aggregated and embedded in self-producing extracellular polymeric substances. Biofilm formation gives many advantages to cells, such as protection from harsh environment, metabolic cooperativity, and easy exchange of gen...
Biofilms are well organized cooperating communities of microorganisms which are aggregated and embedded in self-producing extracellular polymeric substances. Biofilm formation gives many advantages to cells, such as protection from harsh environment, metabolic cooperativity, and easy exchange of genetic information which ensure better survival and adaptation. In this study, I investigated the expressions of genes related to oxidative stress response, secondary metabolite production, and intracellular /extracellular signaling according to the spatial distribution of cells in biofilm. For this, I used a colony biofilm of Pseudomonas aeruginosa, one of the most widely studied model organisms for bacterial biofilms and cell-to-cell signaling. I sorted cells in colony biofilm into several fractions according to the depth from surface of biofilm by physical separation method, and investigated the expressions of the oxidative stress-response genes, anthranilate metabolism genes, Pseudomonas quinolone signal (PQS) synthesis genes, quorum sensing-regulated genes, and cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP)-related genes, as the representative monitoring of the physiology. The results showed that cells in different fractions of biofilm expressed these genes differentially. Expressions of the sensor or regulator protein genes (soxR, oxyR, antR, lasR, rhlR, qscR, pqsR) were maximal in upper layer, decreased in middle layer, and then slightly increased again in bottom layer. The expressions of their target genes (PA2274, katB, antA, lasI, rhlI, PA1897, pqsA) gradually decreased, or rapidly reduced and plateaued in a L-shape. Interestingly, the expression of pelD gradually increased as go deep inside colony biofilm. On the other hand, cells in biofilm differently responded to oxidative stress according to the spatial distribution, where the cells deep inside biofilm lost the responsiveness to oxidative stress. This insensitization was similar with the cells at stationary phase of planktonic culture. My results suggest that even in the biofilm formed by genetically identical cells, their physiology may be not actually homogeneous in biofilm structure.
Biofilms are well organized cooperating communities of microorganisms which are aggregated and embedded in self-producing extracellular polymeric substances. Biofilm formation gives many advantages to cells, such as protection from harsh environment, metabolic cooperativity, and easy exchange of genetic information which ensure better survival and adaptation. In this study, I investigated the expressions of genes related to oxidative stress response, secondary metabolite production, and intracellular /extracellular signaling according to the spatial distribution of cells in biofilm. For this, I used a colony biofilm of Pseudomonas aeruginosa, one of the most widely studied model organisms for bacterial biofilms and cell-to-cell signaling. I sorted cells in colony biofilm into several fractions according to the depth from surface of biofilm by physical separation method, and investigated the expressions of the oxidative stress-response genes, anthranilate metabolism genes, Pseudomonas quinolone signal (PQS) synthesis genes, quorum sensing-regulated genes, and cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP)-related genes, as the representative monitoring of the physiology. The results showed that cells in different fractions of biofilm expressed these genes differentially. Expressions of the sensor or regulator protein genes (soxR, oxyR, antR, lasR, rhlR, qscR, pqsR) were maximal in upper layer, decreased in middle layer, and then slightly increased again in bottom layer. The expressions of their target genes (PA2274, katB, antA, lasI, rhlI, PA1897, pqsA) gradually decreased, or rapidly reduced and plateaued in a L-shape. Interestingly, the expression of pelD gradually increased as go deep inside colony biofilm. On the other hand, cells in biofilm differently responded to oxidative stress according to the spatial distribution, where the cells deep inside biofilm lost the responsiveness to oxidative stress. This insensitization was similar with the cells at stationary phase of planktonic culture. My results suggest that even in the biofilm formed by genetically identical cells, their physiology may be not actually homogeneous in biofilm structure.
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