폭약 공장주변의 RDX (hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine)에 오염된 토양으로부터 RDX를 분해하는 균주인 Pseudomonas putida HK-6를 농화배양하여 분리하였다. Ps. putida HK-6 세균의 형태학적 및 물리적 특성을 조사하였다. Ps. putida HK-6 세균은 그람음성의 막대형이었으며, oxidase 양성, ...
폭약 공장주변의 RDX (hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine)에 오염된 토양으로부터 RDX를 분해하는 균주인 Pseudomonas putida HK-6를 농화배양하여 분리하였다. Ps. putida HK-6 세균의 형태학적 및 물리적 특성을 조사하였다. Ps. putida HK-6 세균은 그람음성의 막대형이었으며, oxidase 양성, catalase 양성, phenylalanine deaminase 실험은 음성으로 나타났으며, 트립토판 가수분해시험과 요소분해시험과 인돌반응은 음성이었고, 녹말을 이용하였으며 H2S를 생산하였다. Ps. putida HK-6의 생화학적 특성은 BIOLOG system을 이용하여 실시되었다. 540 bp의 rpoH DNA조각을 상보적인 두 개의 primer를 이용하여 증폭시키고, EcoRI과 HindIII를 이용하여 잘라낸 후, pBGS18 vector에 삽입하여 rpoH knock-out된 돌연변이 균주를 조립하였다. 야생형의 Ps. putida HK-6 균주과 rpoH 돌연변이 균주를 LB 액체배지에서 24시간동안 배양하였다. 이들 세균은 PBS에 3회 세척하고 0.05 mM의 RDX 배지에 접종하여 50일 동안 배양하였다. Ps. putida HK-6 야생형 균주는 rpoH 돌연변이 균주보다 빠른 RDX 분해율을 나타내었다. Ps. putida HK-6 야생형 균주는 0.05 mM의 RDX를 50일 이내에 완전히 분해한데 비하여, 돌연변이 균주는 같은 기간 동안 약 10%정도 분해되었다. 잔존 RDX은 역상크로마토그래피를 이용하여 결정되었다. RDX를 포함하는 배지에서 생장한 Ps. putida HK-6 균주는 스트레스 충격단백질과 RDX 분해에 관연하는 효소들을 암호화하는 몇가지 유전자를 발현하였다. RDX로 처리된 Ps. putida HK-6 세포는 anti-DnaK 와 anti-GroEL의 단일클론항체를 이용한 웨스턴 블럿팅(western blotting)으로 스트레스 충격 단백질 발현을 분석되었다. Ps. putida HK-6에서 RDX에 노출된 HSP 70 and HSP 60를 암호화하는 dnaK과 groEL 유전자의 전사가 증가되었다. 반면에, rpoH 돌연변이 균주는 RDX에 의한 스트레스에서 dnaK 유전자는 전사되지 않았으며, groEL 유전자는 부분적인 유도되는 것을 보여주었다. rpoH 유전자 (σ32, 스트레스 대응시그마 인자), alg 오페론 (alginate 합성 유전자 클러스터)과 pnrB 유전자 (nitrireductase)는 이들 발현된 유전자들 중에 포함되어있었다. algA와 pnrB 유전자가 σ32에 의해 전사조절이 되는지 조사하기 위하여, 스트레스 상태의 rpoH knock-out된 돌연변이 균주를 HK-6 야생형 균주와 비교하여 그들의 mRNA 양을 RT-qPCR로 측정하였다. algA mRNA의 발현은 rpoH 돌연변이 균주가 야생형 균주보다 약 4∼7배 정도 낮았다. pnrB 유전자의 전사량은 rpoH 돌연변이가 약 3배정도 낮았다. 이들 결과는 RDX를 포함하는 다양한 환경적 스트레스요인들에 의한 σ32 생산이 RDX 분해를 위해서 스트레스충격단백질과 효소의 유도를 위해 필요하다는 것을 나타낸다. RDX에 노출된 Ps. putida HK-6 배양으로부터 수용성 단백질 분획에 대한 이차원 전기영동의 결과는 약 150여개의 spot이 pH 4∼7 범위의 은염색된 겔에서 확인되었다. 이들 spots 가운데, 12개의 단백질이 MALDI-TOF/MS에 의해 분리동정되었다. Ps. putida HK-6의 스트레스 반응과 생존에 중요한 분자 샤페론인 GroEL은 HK-6가 RDX에 노출된 후에 상당히 증가하였다. 또한 GroEL의 발현을 조절하는 RpoH 또한 발현되었다. 그 이외에 발현된 단백질은 세포 외막 단백질 [예, outer membrane protein (OprQ)], 에너지 물질대사 단백질 [예, catechol 2,3-dioxygenase (NahH), phosphatidylserine synthase], 아미노산 생합성 단백질 [예, asparatate transcarbamoyltransferase (PyrB)], 그리고 나머지 단백질 (예., 2-hydroxyacid dehydrogenase, hypothetical protein PPS11_35950)로 동정되었다. RDX에 노출된 Ps. putida HK-6 rpoH knock-out 돌연변이 균주에서 11개의 단백질을 동정하였다. 발현된 단백질은 에너지 물질대사 관련 단백질 [예, 30S ribosomal protein S12 methylthiotransferase (RimO), cysteine desulfurase], 연장인자(elongation factor Ts), 그리고 나머지 단백질 [nitrate ABC transporter substrate-binding protein, NLPA lipoprotein 등)으로 동정되었다. 이들 결과는 RDX 스트레스 상태에서 Ps. putida HK-6의 생존기작에 대한 보다 정확한 이해를 제공한다.
폭약 공장주변의 RDX (hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine)에 오염된 토양으로부터 RDX를 분해하는 균주인 Pseudomonas putida HK-6를 농화배양하여 분리하였다. Ps. putida HK-6 세균의 형태학적 및 물리적 특성을 조사하였다. Ps. putida HK-6 세균은 그람음성의 막대형이었으며, oxidase 양성, catalase 양성, phenylalanine deaminase 실험은 음성으로 나타났으며, 트립토판 가수분해시험과 요소분해시험과 인돌반응은 음성이었고, 녹말을 이용하였으며 H2S를 생산하였다. Ps. putida HK-6의 생화학적 특성은 BIOLOG system을 이용하여 실시되었다. 540 bp의 rpoH DNA조각을 상보적인 두 개의 primer를 이용하여 증폭시키고, EcoRI과 HindIII를 이용하여 잘라낸 후, pBGS18 vector에 삽입하여 rpoH knock-out된 돌연변이 균주를 조립하였다. 야생형의 Ps. putida HK-6 균주과 rpoH 돌연변이 균주를 LB 액체배지에서 24시간동안 배양하였다. 이들 세균은 PBS에 3회 세척하고 0.05 mM의 RDX 배지에 접종하여 50일 동안 배양하였다. Ps. putida HK-6 야생형 균주는 rpoH 돌연변이 균주보다 빠른 RDX 분해율을 나타내었다. Ps. putida HK-6 야생형 균주는 0.05 mM의 RDX를 50일 이내에 완전히 분해한데 비하여, 돌연변이 균주는 같은 기간 동안 약 10%정도 분해되었다. 잔존 RDX은 역상크로마토그래피를 이용하여 결정되었다. RDX를 포함하는 배지에서 생장한 Ps. putida HK-6 균주는 스트레스 충격단백질과 RDX 분해에 관연하는 효소들을 암호화하는 몇가지 유전자를 발현하였다. RDX로 처리된 Ps. putida HK-6 세포는 anti-DnaK 와 anti-GroEL의 단일클론항체를 이용한 웨스턴 블럿팅(western blotting)으로 스트레스 충격 단백질 발현을 분석되었다. Ps. putida HK-6에서 RDX에 노출된 HSP 70 and HSP 60를 암호화하는 dnaK과 groEL 유전자의 전사가 증가되었다. 반면에, rpoH 돌연변이 균주는 RDX에 의한 스트레스에서 dnaK 유전자는 전사되지 않았으며, groEL 유전자는 부분적인 유도되는 것을 보여주었다. rpoH 유전자 (σ32, 스트레스 대응 시그마 인자), alg 오페론 (alginate 합성 유전자 클러스터)과 pnrB 유전자 (nitrireductase)는 이들 발현된 유전자들 중에 포함되어있었다. algA와 pnrB 유전자가 σ32에 의해 전사조절이 되는지 조사하기 위하여, 스트레스 상태의 rpoH knock-out된 돌연변이 균주를 HK-6 야생형 균주와 비교하여 그들의 mRNA 양을 RT-qPCR로 측정하였다. algA mRNA의 발현은 rpoH 돌연변이 균주가 야생형 균주보다 약 4∼7배 정도 낮았다. pnrB 유전자의 전사량은 rpoH 돌연변이가 약 3배정도 낮았다. 이들 결과는 RDX를 포함하는 다양한 환경적 스트레스요인들에 의한 σ32 생산이 RDX 분해를 위해서 스트레스충격단백질과 효소의 유도를 위해 필요하다는 것을 나타낸다. RDX에 노출된 Ps. putida HK-6 배양으로부터 수용성 단백질 분획에 대한 이차원 전기영동의 결과는 약 150여개의 spot이 pH 4∼7 범위의 은염색된 겔에서 확인되었다. 이들 spots 가운데, 12개의 단백질이 MALDI-TOF/MS에 의해 분리동정되었다. Ps. putida HK-6의 스트레스 반응과 생존에 중요한 분자 샤페론인 GroEL은 HK-6가 RDX에 노출된 후에 상당히 증가하였다. 또한 GroEL의 발현을 조절하는 RpoH 또한 발현되었다. 그 이외에 발현된 단백질은 세포 외막 단백질 [예, outer membrane protein (OprQ)], 에너지 물질대사 단백질 [예, catechol 2,3-dioxygenase (NahH), phosphatidylserine synthase], 아미노산 생합성 단백질 [예, asparatate transcarbamoyltransferase (PyrB)], 그리고 나머지 단백질 (예., 2-hydroxyacid dehydrogenase, hypothetical protein PPS11_35950)로 동정되었다. RDX에 노출된 Ps. putida HK-6 rpoH knock-out 돌연변이 균주에서 11개의 단백질을 동정하였다. 발현된 단백질은 에너지 물질대사 관련 단백질 [예, 30S ribosomal protein S12 methylthiotransferase (RimO), cysteine desulfurase], 연장인자(elongation factor Ts), 그리고 나머지 단백질 [nitrate ABC transporter substrate-binding protein, NLPA lipoprotein 등)으로 동정되었다. 이들 결과는 RDX 스트레스 상태에서 Ps. putida HK-6의 생존기작에 대한 보다 정확한 이해를 제공한다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.