비타민 C 는 잘 알려진 대로, 수용성 영양소로 강력한 항산화제로 알려져 있다. 또한 모든 살아있는 세포의 필수요소 이기도 하다. 항산화 효과 외에도 비타민 C 는 암세포의 성장을 억제하는 것으로 In vitro 실험에서 보고되고 있다. 그러나, 암세포에서의 비타민 C의 효과에 관해서는 아직 논란이 많으나, 비타민 C가 포함된 많은 양의 신선한 과일이나 채소를 섭취하는 것은 대부분의 암이 걸릴 확률을 낮춰주는 것과 연관이 있다. 그러므로, 이번 연구에서 위암세포주인 AGS 세포를 이용하여 비타민 C의 항암 및 항증식효과에 대하여 알아보았고, 비타민 C를 생성하지 못하는 mice model인 Gulo-/- mice를 이용하여 사람과 비슷한 환경을 만들어 비타민 C 방어 기작을 알아보고 단백체연구를 통해 ...
비타민 C 는 잘 알려진 대로, 수용성 영양소로 강력한 항산화제로 알려져 있다. 또한 모든 살아있는 세포의 필수요소 이기도 하다. 항산화 효과 외에도 비타민 C 는 암세포의 성장을 억제하는 것으로 In vitro 실험에서 보고되고 있다. 그러나, 암세포에서의 비타민 C의 효과에 관해서는 아직 논란이 많으나, 비타민 C가 포함된 많은 양의 신선한 과일이나 채소를 섭취하는 것은 대부분의 암이 걸릴 확률을 낮춰주는 것과 연관이 있다. 그러므로, 이번 연구에서 위암세포주인 AGS 세포를 이용하여 비타민 C의 항암 및 항증식효과에 대하여 알아보았고, 비타민 C를 생성하지 못하는 mice model인 Gulo-/- mice를 이용하여 사람과 비슷한 환경을 만들어 비타민 C 방어 기작을 알아보고 단백체연구를 통해 바이오마커를 찾아보았다. 비타민 C는 AGS 세포주에서 세포독성을 나타내었다 (LD50 value = 300µg/ml). 나아가, 유세포 분석 실험에서 비타민 C는 sub-G1기의 숫자를 늘렸고 fluorescein isothiocyanate-Annexin V double stain 실험에서 세포사멸의 증가를 확인하였다. 또한, western blot 실험에서 phosphor-bad, 14-3-3σ, pro-caspase-3, -6, -8, 그리고 -9 단백질의 발현이 감소하였고 Bax/Bcl-xL의 비율이 농도구배로 증가 하였다. Wound healing 실험에서는 비타민 C가 AGS 세포주의 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 비타민 C가 약리학적 농도 (300 µg/m)에서 세포사멸을 일으키는 것을 의미하여 앞서 언급한 단백질들의 발현패턴으로 보아 미토콘드리아 의존적인 기전으로로 세포사멸을 일으키는 것으로 확인되었다. 다음으로, 우리는 단백체 분석 실험을 통해 AGS 세포에 비타민 C를 투여 하였을 때 그렇지 않은 대조군과 비교하여 어떤 단백질들이 다르게 발현되는지 MALDI-TOF/MS 분석을 통해 알아보았다. 단백체 분석결과 20개의 단백질들이 다르게 발현되는 것으로 나타났으며 이중 6개는 증가하는 패턴으로, 14개는 감소하는 패턴으로 나타났다. 특히, 세포 구조 단백질, 신호전달 단백질들이 감소하였고, 해독작용, 산화환원 반응과 관련된 단백질 들은 증가하는 패턴을 보였다. 또한, 14-3-3 아형은 western blot분석 실험에서도 다시한번 확인 할 수 있었다. 이 단백체 분석 실험은 비타민 C가 세포성장을 억제하고 세포사멸을 일으키는 단백질들의 발현과 연관이 있다는 것을 보여준다. 종합하여 볼 때, In vitro 결과는 비타민 C가 위암의 치료물질로 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 다른 대다수의 동물들과는 달리 사람은 비타민 C를 합성할 수 있는 능력이 없다. 그러므로 사람은 비타민 C를 반드시 식이적으로 섭취하여야 하며 그 양은 개인에 따라 다르다. 최근의 발전된 단백체 분석 실험에서는 바이오마커를 찾는 것이 가장 중요한 분야중 하나이다. Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) MS 분석을 동물의 조직 과 같은 것에서 바이오마커를 찾는데 매우 적합한 실험방법이다. 따라서, 우리는 사람과 같은 비타민 C를 합성할 수 없는 Gulo-/- mice를 이용하여 proteomic 분석기법에 따라 바이오마커를 찾아보았다. Gulo-/- mice 를 대조군과 Helicobactor pylori 감염군, Helicobactor pylori 와 Diethylnitrosamine(DENA)를 처리한 군으로 나누었다. 각각의 군에는 모두 비타민 C를 (20mg/animal/day)로 공급하였다. 48주 뒤, 모든 개체를 희생시켜 혈청, 위, 간 조직을 채취 하였다. 면역염색실험에서 위조직에서는 암 억제 인자인 p53의 발현이 감소하였고, 14-3-3ε, 14-3-3δ의 발현이 H.pylori 감염군과 H.pylori 감염시킨 뒤 DENA를 같이 처리한 군에서 증가하였다. 그러나 간의 면역염색법에서는 p53의 발현이 조금 다르게 나타났고, 14-3-3ε, 14-3-3δ의 발현은 변함이 없었다. 위 조직의 2-DE map에서는 총 29개의 단백질이 다르게 발현되는 것이 MALDI-TOF/MS 분석기법을 통에 분석되었고, 총 24개의 단백질을 최종적으로 확인할 수 있었다. 이들 중, 14-3-3sigma, chitinase 3 like 4 전구체, Hspd1 단백질, HSP70 단백질, alpha-fetoprotein, Chia 단백질 등이 중요한 단백질로 밝혀졌다. 혈청의 2-DE map 분석에서는 46개의 단백질이 다르게 발현되었고, 15개의 단백질을 최종적으로 확인 할 수 있었다. 이들 중, collagen alpha-2(IX) chain, Alpha-1-antitrypsin 1-4, peroxiredoxin-6, ferritin heavy chain 등이 중요한 단백질로 밝혀졌다. In vitro 분석실험 에서는 비타민 C가 위암의 치료제로서의 가능성을 알 수 있었다. 그리고, 단백체결과 에서 AGS 세포주의 세포사멸 와 관련된 단백질과 14-3-3 단백질이 잠재적 진단 marker로 이용될 수 있다는 것을 보여 주었다. In vivo 실험에서는 조직과 혈청 분석에서 진단적 바이오마커로 쓰일 수 있는 단백질들을 발견하였으며 향후 위암의 초기 발견에 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
비타민 C 는 잘 알려진 대로, 수용성 영양소로 강력한 항산화제로 알려져 있다. 또한 모든 살아있는 세포의 필수요소 이기도 하다. 항산화 효과 외에도 비타민 C 는 암세포의 성장을 억제하는 것으로 In vitro 실험에서 보고되고 있다. 그러나, 암세포에서의 비타민 C의 효과에 관해서는 아직 논란이 많으나, 비타민 C가 포함된 많은 양의 신선한 과일이나 채소를 섭취하는 것은 대부분의 암이 걸릴 확률을 낮춰주는 것과 연관이 있다. 그러므로, 이번 연구에서 위암세포주인 AGS 세포를 이용하여 비타민 C의 항암 및 항증식효과에 대하여 알아보았고, 비타민 C를 생성하지 못하는 mice model인 Gulo-/- mice를 이용하여 사람과 비슷한 환경을 만들어 비타민 C 방어 기작을 알아보고 단백체연구를 통해 바이오마커를 찾아보았다. 비타민 C는 AGS 세포주에서 세포독성을 나타내었다 (LD50 value = 300µg/ml). 나아가, 유세포 분석 실험에서 비타민 C는 sub-G1기의 숫자를 늘렸고 fluorescein isothiocyanate-Annexin V double stain 실험에서 세포사멸의 증가를 확인하였다. 또한, western blot 실험에서 phosphor-bad, 14-3-3σ, pro-caspase-3, -6, -8, 그리고 -9 단백질의 발현이 감소하였고 Bax/Bcl-xL의 비율이 농도구배로 증가 하였다. Wound healing 실험에서는 비타민 C가 AGS 세포주의 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 비타민 C가 약리학적 농도 (300 µg/m)에서 세포사멸을 일으키는 것을 의미하여 앞서 언급한 단백질들의 발현패턴으로 보아 미토콘드리아 의존적인 기전으로로 세포사멸을 일으키는 것으로 확인되었다. 다음으로, 우리는 단백체 분석 실험을 통해 AGS 세포에 비타민 C를 투여 하였을 때 그렇지 않은 대조군과 비교하여 어떤 단백질들이 다르게 발현되는지 MALDI-TOF/MS 분석을 통해 알아보았다. 단백체 분석결과 20개의 단백질들이 다르게 발현되는 것으로 나타났으며 이중 6개는 증가하는 패턴으로, 14개는 감소하는 패턴으로 나타났다. 특히, 세포 구조 단백질, 신호전달 단백질들이 감소하였고, 해독작용, 산화환원 반응과 관련된 단백질 들은 증가하는 패턴을 보였다. 또한, 14-3-3 아형은 western blot분석 실험에서도 다시한번 확인 할 수 있었다. 이 단백체 분석 실험은 비타민 C가 세포성장을 억제하고 세포사멸을 일으키는 단백질들의 발현과 연관이 있다는 것을 보여준다. 종합하여 볼 때, In vitro 결과는 비타민 C가 위암의 치료물질로 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 다른 대다수의 동물들과는 달리 사람은 비타민 C를 합성할 수 있는 능력이 없다. 그러므로 사람은 비타민 C를 반드시 식이적으로 섭취하여야 하며 그 양은 개인에 따라 다르다. 최근의 발전된 단백체 분석 실험에서는 바이오마커를 찾는 것이 가장 중요한 분야중 하나이다. Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) MS 분석을 동물의 조직 과 같은 것에서 바이오마커를 찾는데 매우 적합한 실험방법이다. 따라서, 우리는 사람과 같은 비타민 C를 합성할 수 없는 Gulo-/- mice를 이용하여 proteomic 분석기법에 따라 바이오마커를 찾아보았다. Gulo-/- mice 를 대조군과 Helicobactor pylori 감염군, Helicobactor pylori 와 Diethylnitrosamine(DENA)를 처리한 군으로 나누었다. 각각의 군에는 모두 비타민 C를 (20mg/animal/day)로 공급하였다. 48주 뒤, 모든 개체를 희생시켜 혈청, 위, 간 조직을 채취 하였다. 면역염색실험에서 위조직에서는 암 억제 인자인 p53의 발현이 감소하였고, 14-3-3ε, 14-3-3δ의 발현이 H.pylori 감염군과 H.pylori 감염시킨 뒤 DENA를 같이 처리한 군에서 증가하였다. 그러나 간의 면역염색법에서는 p53의 발현이 조금 다르게 나타났고, 14-3-3ε, 14-3-3δ의 발현은 변함이 없었다. 위 조직의 2-DE map에서는 총 29개의 단백질이 다르게 발현되는 것이 MALDI-TOF/MS 분석기법을 통에 분석되었고, 총 24개의 단백질을 최종적으로 확인할 수 있었다. 이들 중, 14-3-3sigma, chitinase 3 like 4 전구체, Hspd1 단백질, HSP70 단백질, alpha-fetoprotein, Chia 단백질 등이 중요한 단백질로 밝혀졌다. 혈청의 2-DE map 분석에서는 46개의 단백질이 다르게 발현되었고, 15개의 단백질을 최종적으로 확인 할 수 있었다. 이들 중, collagen alpha-2(IX) chain, Alpha-1-antitrypsin 1-4, peroxiredoxin-6, ferritin heavy chain 등이 중요한 단백질로 밝혀졌다. In vitro 분석실험 에서는 비타민 C가 위암의 치료제로서의 가능성을 알 수 있었다. 그리고, 단백체결과 에서 AGS 세포주의 세포사멸 와 관련된 단백질과 14-3-3 단백질이 잠재적 진단 marker로 이용될 수 있다는 것을 보여 주었다. In vivo 실험에서는 조직과 혈청 분석에서 진단적 바이오마커로 쓰일 수 있는 단백질들을 발견하였으며 향후 위암의 초기 발견에 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
Vitamin C (ascorbic acid) is a well-known, water-soluble nutrient that readily acts as a strong reducing agent. It is an essential component of most living tissues. Apart from antioxidant activity, it has been reported to inhibit cancer cell growth in vitro in human cancer cells. Although, the effec...
Vitamin C (ascorbic acid) is a well-known, water-soluble nutrient that readily acts as a strong reducing agent. It is an essential component of most living tissues. Apart from antioxidant activity, it has been reported to inhibit cancer cell growth in vitro in human cancer cells. Although, the effect of vitamin C in cancer treatment remains controversial, a high intake of fresh fruits and vegetables which contain vitamin C is associated with a reduced risk for most types of cancer. Therefore, the present study was design to study the anticancer and anti-proliferative activity of Vitamin C (ascorbic acid) on gastric cancer cell line AGS. A Gulo-/- mice model like human (it can’t synthesis vitamin C) was also investigated for protection effect of vitamin C and biomarkers of gastric cancer by a proteomic approach. Vitamin C showed a cytotoxic effect on human gastric cancer cell line AGS (LD50 300 µg/ml). Flow cytometry analysis showed that vitamin C increased the sub-G1 (apoptosis) population and apoptosis confirmed by fluorescein isothiocyanate-Annexin V double staining in AGS cells. Moreover, specific immuno-blotting revealed the expression of the phosphorylated form of Bad (S136), 14-3-3σ, pro-caspases-3, -6, -8, and-9 protein levels were significantly decreased and Bax/Bcl-xL ratio was increased in a dose-dependent manner. Wound healing assay results showed that vitamin C inhibited AGS cell proliferation. These findings revealed that vitamin C at pharmacological concentrations (300µg/ml) induces apoptosis in AGS cells mainly through the down-regulation of 14–3-3σ protein and dephosphorylates Bad proteins, which increase the Bax/Bcl-xL ratio, resulting in apoptosis via a mitochondrial dependent pathway. Further, proteome analysis performed on the AGS cells treated with vitamin C at pharmacological concentrations (300µg/ml). Differentially expressed proteins were identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight and mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Proteomic analysis revealed 20 differentially expressed proteins, of which six were up-regulated and fourteen were down-regulated. In particular, cytoskeletal and signal transduction related proteins were down-regulated, and detoxification and redox proteins were up-regulated in the vitamin C-treated AGS cells compared with the control. The expressions of 14-3-3 isoforms were also verified with immuno-blotting analysis. These proteome results revealed that vitamin C inhibited the cell growth, and apoptosis related proteins were involved in promoting and regulating cell death in AGS cells. Taken together, in vitro research findings suggest that vitamin C might be a potential therapeutic agent for gastric cancer. Unlike most other mammals and animals, human bodies do not have the ability to synthesis vitamin C inside of their own bodies. Therefore, humans must obtain vitamin C through daily diet. With recent advances in proteomics protein biomarker discovery is become one of the of proteome research. Screening methods of proteome by MALDI-TOF/MS analyses of animal samples like stomach tissues, liver and serum are promising technologies for biomarker discovery. A Gulo-/- mice model was also investigated for the discovery of biomarkers of gastric cancer by a proteomic approach. The knock-out mice were divided into three groups; control group, Helicobacter pylori-infected group and the group of H.pylori infection followed by Diethylnitrosamine (DENA) treatment. All these three groups were supplemented vitamin C (20mg/animal/day, PO) and only group 3 treated DENA (10mg/L, PO). After 48 weeks, all animals were sacrificed and serum, stomach and liver were collected. Immunohistochemistry of stomach tissue showed that a tumor suppressor p53 was decreased, and 14-3-3ε and 14-3-3δ expressions were increased in H. Pylori-infected group and H. Pylori +DENA group when compare with the control group. However, little difference was found in p53 and no difference in 14-3-3ε and 14-3-3δ expression in the liver tissue. In 2-DE maps of stomach tissue, a total of 29 differentially expressed spots were analyzed by MALDI-TOF/TOF MS and 24 proteins significantly identified. Some of the important proteins including 14-3-3 protein sigma, chitinase 3-like 4 precursor, Hspd1 protein, HSC70 protein, alpha-fetoprotein, and Chia protein. In 2-DE maps of serum, a total of 46 differentially expressed proteins spots were analysis and successfully identified 38 proteins by MALDI-TOF MS. Some of the important proteins including collagen alpha-2(IX) chain, as haptoglobin, alpha-1B-glycoprotein, apolipoprotein A-IV, glutathione S-transferase, complement C3. In 2-DE maps of liver, a total of 16 differentially expressed proteins spots were analysis and successfully identified 12 proteins by MALDI-TOF MS. Some of the important proteins including collagen alpha-2(IX) chain, Alpha-1-antitrypsin 1-4, peroxiredoxin-6 and ferritin heavy chain. The current in vitro study suggests that vitamin C might be a potential therapeutic agent for gastric cancer. Proteomic results revealed that apoptosis related proteins were involved in promoting and regulating cell death of AGS cells and 14-3-3 proteins may be potential diagnostic biomarkers and therapeutic targets of gastric cancer. In vivo study suggests that gastric cancer was induced in vitamin C deficiency mice by H.pylori infection which was enhanced by DENA. Some proteins identified may serve potential biomarkers for the diagnosis and can be a potential therapeutic target of gastric cancer.
Vitamin C (ascorbic acid) is a well-known, water-soluble nutrient that readily acts as a strong reducing agent. It is an essential component of most living tissues. Apart from antioxidant activity, it has been reported to inhibit cancer cell growth in vitro in human cancer cells. Although, the effect of vitamin C in cancer treatment remains controversial, a high intake of fresh fruits and vegetables which contain vitamin C is associated with a reduced risk for most types of cancer. Therefore, the present study was design to study the anticancer and anti-proliferative activity of Vitamin C (ascorbic acid) on gastric cancer cell line AGS. A Gulo-/- mice model like human (it can’t synthesis vitamin C) was also investigated for protection effect of vitamin C and biomarkers of gastric cancer by a proteomic approach. Vitamin C showed a cytotoxic effect on human gastric cancer cell line AGS (LD50 300 µg/ml). Flow cytometry analysis showed that vitamin C increased the sub-G1 (apoptosis) population and apoptosis confirmed by fluorescein isothiocyanate-Annexin V double staining in AGS cells. Moreover, specific immuno-blotting revealed the expression of the phosphorylated form of Bad (S136), 14-3-3σ, pro-caspases-3, -6, -8, and-9 protein levels were significantly decreased and Bax/Bcl-xL ratio was increased in a dose-dependent manner. Wound healing assay results showed that vitamin C inhibited AGS cell proliferation. These findings revealed that vitamin C at pharmacological concentrations (300µg/ml) induces apoptosis in AGS cells mainly through the down-regulation of 14–3-3σ protein and dephosphorylates Bad proteins, which increase the Bax/Bcl-xL ratio, resulting in apoptosis via a mitochondrial dependent pathway. Further, proteome analysis performed on the AGS cells treated with vitamin C at pharmacological concentrations (300µg/ml). Differentially expressed proteins were identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight and mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Proteomic analysis revealed 20 differentially expressed proteins, of which six were up-regulated and fourteen were down-regulated. In particular, cytoskeletal and signal transduction related proteins were down-regulated, and detoxification and redox proteins were up-regulated in the vitamin C-treated AGS cells compared with the control. The expressions of 14-3-3 isoforms were also verified with immuno-blotting analysis. These proteome results revealed that vitamin C inhibited the cell growth, and apoptosis related proteins were involved in promoting and regulating cell death in AGS cells. Taken together, in vitro research findings suggest that vitamin C might be a potential therapeutic agent for gastric cancer. Unlike most other mammals and animals, human bodies do not have the ability to synthesis vitamin C inside of their own bodies. Therefore, humans must obtain vitamin C through daily diet. With recent advances in proteomics protein biomarker discovery is become one of the of proteome research. Screening methods of proteome by MALDI-TOF/MS analyses of animal samples like stomach tissues, liver and serum are promising technologies for biomarker discovery. A Gulo-/- mice model was also investigated for the discovery of biomarkers of gastric cancer by a proteomic approach. The knock-out mice were divided into three groups; control group, Helicobacter pylori-infected group and the group of H.pylori infection followed by Diethylnitrosamine (DENA) treatment. All these three groups were supplemented vitamin C (20mg/animal/day, PO) and only group 3 treated DENA (10mg/L, PO). After 48 weeks, all animals were sacrificed and serum, stomach and liver were collected. Immunohistochemistry of stomach tissue showed that a tumor suppressor p53 was decreased, and 14-3-3ε and 14-3-3δ expressions were increased in H. Pylori-infected group and H. Pylori +DENA group when compare with the control group. However, little difference was found in p53 and no difference in 14-3-3ε and 14-3-3δ expression in the liver tissue. In 2-DE maps of stomach tissue, a total of 29 differentially expressed spots were analyzed by MALDI-TOF/TOF MS and 24 proteins significantly identified. Some of the important proteins including 14-3-3 protein sigma, chitinase 3-like 4 precursor, Hspd1 protein, HSC70 protein, alpha-fetoprotein, and Chia protein. In 2-DE maps of serum, a total of 46 differentially expressed proteins spots were analysis and successfully identified 38 proteins by MALDI-TOF MS. Some of the important proteins including collagen alpha-2(IX) chain, as haptoglobin, alpha-1B-glycoprotein, apolipoprotein A-IV, glutathione S-transferase, complement C3. In 2-DE maps of liver, a total of 16 differentially expressed proteins spots were analysis and successfully identified 12 proteins by MALDI-TOF MS. Some of the important proteins including collagen alpha-2(IX) chain, Alpha-1-antitrypsin 1-4, peroxiredoxin-6 and ferritin heavy chain. The current in vitro study suggests that vitamin C might be a potential therapeutic agent for gastric cancer. Proteomic results revealed that apoptosis related proteins were involved in promoting and regulating cell death of AGS cells and 14-3-3 proteins may be potential diagnostic biomarkers and therapeutic targets of gastric cancer. In vivo study suggests that gastric cancer was induced in vitamin C deficiency mice by H.pylori infection which was enhanced by DENA. Some proteins identified may serve potential biomarkers for the diagnosis and can be a potential therapeutic target of gastric cancer.
주제어
#Gastric cancer Vitamin C Proteome analysis 14-3-3 isoforms gulo (-/-) mouse
학위논문 정보
저자
Nagappan Arul kumar
학위수여기관
경상대학교 대학원
학위구분
국내박사
학과
수의학과 생화학
발행연도
2013
총페이지
xx, 106 p.
키워드
Gastric cancer Vitamin C Proteome analysis 14-3-3 isoforms gulo (-/-) mouse
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