신선초의 부위별 2차대사체 프로파일링과 xanthine oxidase 저해활성 신선초 (Angelica keiskei)는 아열대 지방에서 자생하는 미나리 과에 속하는 다년생식물로 원산지는 일본이다. 신선초의 주요 활성 2차대사체는 coumarin 및 ...
신선초의 부위별 2차대사체 프로파일링과 xanthine oxidase 저해활성 신선초 (Angelica keiskei)는 아열대 지방에서 자생하는 미나리 과에 속하는 다년생식물로 원산지는 일본이다. 신선초의 주요 활성 2차대사체는 coumarin 및 chalcone 계열 화합물로 알려져 있으며, 현재 알려진 신선초의 효능은 빈혈, 고혈압, 당뇨, 신경통예방 등이 있으며, 최근에는 항암, 혈액순환, 혈압조절, 위산과다분비 조절 등 생리활성이 보고되었다. 이러한 신선초는 전초 (whole plant)가 식품으로 이용되고 있으며 건강기능성식품의 목적에 따라 부위별 (잎, 줄기, 뿌리)로도 이용되고 있다. 따라서 신선초의 부위별 2차대사체의 정량 및 정성분석을 포함한 대사체 프로파일링 연구는 신선초의 효과적인 이용에 필수적으로 요구된다. 본 연구에서는 신선초의 2차대사체에 대한 분리, 정제 및 구조 동정하여 정량 및 정성분석을 가능케 하는 대사체 라이브러리를 확보하였다. 잎, 줄기, 뿌리껍질, 뿌리 의 2차대사체를 평가할 수 있는 각 부위별 대사체 프로파일링을 분석하여, 각 대사체를 동시에 정량분석 할 수 있는 MRM (Multiple Reaction Monitoring)법을 LC-ESI-MS/MS기기로 완성하였다. 또한 각 대사체의 변화 경향을 이해할 수 있는 다변량 분석을 수행하였다. 2차대사체의 새로운 활성연구에서 chalcone 계열 화합물이 높은 xanthine oxidase 저해활성이 갖는 것을 확인하였고, 이들의 저해 메카니즘을 확인하였다. 그 결과를 요약하면 아래와 같다. 1) 신선초의 활성 대사체 분리 및 구조분석 대사체 프로파일링 및 MRM분석연구의 핵심요소는 대사체 라이브러리를 확보하는 것이다. 신선초 뿌리에서 2차대사체를 분리, 정제 및 구조 분석하여 16종의 대사체 지표물질을 확보하였다. 분광학적 자료를 이용한 구조분석을 통하여 분리된 대사체는 psoralen (1), xanthotoxin (2), bergapten (3), isopimpinellin (4), isoimperatorin (5), isopsoralen (6), selinidin (7), pteryxin (8), laserpitin (9), isolaserpitin (10), demethylsuberosin (11), 4-hydroxyderricin (12), isobavachalcone (13), xanthoangelol F (14), xnathoangelol (15), xanthoangelol B (16)으로 규명되었다. 그 중 11종의 화합물 (1-11)은 coumarin류, 5종의 화합물 (12-16)은 chalcone류임을 확인하였다. 2) 2차 대사체의 프로파일링 분석 LC-ESI-MS/MS기기를 이용하여 신선초의 각 부위별 대사체 함량을 분석하기 위해 다성분 동시 정량기법인 MRM mode로 수행하였다. 대사체 별 검출 한계농도 (LOD)는 0.44-44.39 ug/kg, 정량한계농도 (LOQ)는 1.47-147.99 ug/kg으로 최적화된 조건으로 실시하였다. 전체적인 함량은 뿌리 속 (47.46 ± 2.56 mg/g) > 뿌리 껍질(43.17 ± 3.33 mg/g) > 줄기(14.49 ± 0.76 mg/g) > 잎 (7.58 ± 0.35 mg/g) 순으로 나타났다. 특히, psoralen과 xanthotoxin은 뿌리 속에서 56.7%, 33.0%, 뿌리 껍질에서는 42.1 %, 15.9% 비율을 차지하였고, 4-hydroxyderricin, xanthonagelol의 경우 뿌리껍질에서 7.2%, 13.2%, 줄기에서는 13.3% 35.5%로 확인되었다. 기능성 식품소재로 가장 많이 활용되는 잎에서는 상대적으로 낮은 대사체 함량을 나타내었다. 3) 신선초 부위별 대사체의 다변량분석 2차 대사체의 주성분분석을 통하여 신선초의 4가지 부위별 양상을 분석하였다. 통계분석은 16개의 대사체 피이크, 각 피이크들의 면적 및 4가지 부위에서 추출된 시료로 실시하였다. Loading plot은 각 대사체를 4개의 그룹으로 구분 지었다; 그룹 1 (xanthoangelol, 4-hydroxyderricin, imperatorin, isolaserpin, isobavachalcone), 그룹 2 (pteryxin, laserpitin, xanthonagelol B, selinidin), 그룹 3 (isopimpinellin, bergapten, isopsoralen), 그룹 4 (demethylsuberosin, psoralen). 예를 들면, 그룹 1은 뿌리껍질과 뿌리 속을 결정짓는 주요 대사체로 확인되었으며, 그룹 3은 잎과 줄기의 대사체를 결정짓는 요인으로 확인되었다. 4) 신선초의 xanthine oxidase 활성 평가 신선초의 부위별 활성 결과에서는 메탄올로 추출된 뿌리 껍질이 높은 xanthine oxidase 저해활성 (40%, 200 ug/ml)이 관찰되었고, 대사체별 활성 연구 결과 5종의 chalcone계 화합물이 선도화합물로 확인되었다. 이들은 xanthine oxidase에 대해 농도 의존적인 저해활성 (IC50s = 8.1 – 54.3 uM)을 나타내는 대사체임을 확인하였다. 이들의 저해모드 양상 실험결과 Vmax가 감소하고 Km이 증가하는 전형적인 mixed-type 저해 양상을 나타내었고, Lineweaver-Burk plot을 재도식화하여 KIS와 KI 상수를 비교한 결과 KIS가 KI보다 높게 나타나는 mixed type I 저해제임을 확인하였다. 요약하면, 신선초 부위별 2차대사체에 대한 전체적인 프로파일링 연구를 위해 신선초 뿌리로부터 주요활성 대사체인 coumarin과 chalcone 계열화합물 16종을 분리, 정제 및 구조 동정하였다. LC-ESI-MS/MS기기를 이용하여 각 대사체를 동시에 정성 및 정량 하는 MRM 분석법을 설정하였고, 이들의 부위별 대사체의 함량을 확인한 후, 분석된 함량 결과의 유의성과 부위별 대사체 변화 패턴을 PCA로 확인하였다. 또한 신선초에서 지금까지 보고되지 않았던 xanthine oxidase 저해활성을 관찰하고, 이들의 활성 대사체가 chalcone 계열화합물임을 밝혔다.
신선초의 부위별 2차대사체 프로파일링과 xanthine oxidase 저해활성 신선초 (Angelica keiskei)는 아열대 지방에서 자생하는 미나리 과에 속하는 다년생식물로 원산지는 일본이다. 신선초의 주요 활성 2차대사체는 coumarin 및 chalcone 계열 화합물로 알려져 있으며, 현재 알려진 신선초의 효능은 빈혈, 고혈압, 당뇨, 신경통예방 등이 있으며, 최근에는 항암, 혈액순환, 혈압조절, 위산과다분비 조절 등 생리활성이 보고되었다. 이러한 신선초는 전초 (whole plant)가 식품으로 이용되고 있으며 건강기능성식품의 목적에 따라 부위별 (잎, 줄기, 뿌리)로도 이용되고 있다. 따라서 신선초의 부위별 2차대사체의 정량 및 정성분석을 포함한 대사체 프로파일링 연구는 신선초의 효과적인 이용에 필수적으로 요구된다. 본 연구에서는 신선초의 2차대사체에 대한 분리, 정제 및 구조 동정하여 정량 및 정성분석을 가능케 하는 대사체 라이브러리를 확보하였다. 잎, 줄기, 뿌리껍질, 뿌리 의 2차대사체를 평가할 수 있는 각 부위별 대사체 프로파일링을 분석하여, 각 대사체를 동시에 정량분석 할 수 있는 MRM (Multiple Reaction Monitoring)법을 LC-ESI-MS/MS기기로 완성하였다. 또한 각 대사체의 변화 경향을 이해할 수 있는 다변량 분석을 수행하였다. 2차대사체의 새로운 활성연구에서 chalcone 계열 화합물이 높은 xanthine oxidase 저해활성이 갖는 것을 확인하였고, 이들의 저해 메카니즘을 확인하였다. 그 결과를 요약하면 아래와 같다. 1) 신선초의 활성 대사체 분리 및 구조분석 대사체 프로파일링 및 MRM분석연구의 핵심요소는 대사체 라이브러리를 확보하는 것이다. 신선초 뿌리에서 2차대사체를 분리, 정제 및 구조 분석하여 16종의 대사체 지표물질을 확보하였다. 분광학적 자료를 이용한 구조분석을 통하여 분리된 대사체는 psoralen (1), xanthotoxin (2), bergapten (3), isopimpinellin (4), isoimperatorin (5), isopsoralen (6), selinidin (7), pteryxin (8), laserpitin (9), isolaserpitin (10), demethylsuberosin (11), 4-hydroxyderricin (12), isobavachalcone (13), xanthoangelol F (14), xnathoangelol (15), xanthoangelol B (16)으로 규명되었다. 그 중 11종의 화합물 (1-11)은 coumarin류, 5종의 화합물 (12-16)은 chalcone류임을 확인하였다. 2) 2차 대사체의 프로파일링 분석 LC-ESI-MS/MS기기를 이용하여 신선초의 각 부위별 대사체 함량을 분석하기 위해 다성분 동시 정량기법인 MRM mode로 수행하였다. 대사체 별 검출 한계농도 (LOD)는 0.44-44.39 ug/kg, 정량한계농도 (LOQ)는 1.47-147.99 ug/kg으로 최적화된 조건으로 실시하였다. 전체적인 함량은 뿌리 속 (47.46 ± 2.56 mg/g) > 뿌리 껍질(43.17 ± 3.33 mg/g) > 줄기(14.49 ± 0.76 mg/g) > 잎 (7.58 ± 0.35 mg/g) 순으로 나타났다. 특히, psoralen과 xanthotoxin은 뿌리 속에서 56.7%, 33.0%, 뿌리 껍질에서는 42.1 %, 15.9% 비율을 차지하였고, 4-hydroxyderricin, xanthonagelol의 경우 뿌리껍질에서 7.2%, 13.2%, 줄기에서는 13.3% 35.5%로 확인되었다. 기능성 식품소재로 가장 많이 활용되는 잎에서는 상대적으로 낮은 대사체 함량을 나타내었다. 3) 신선초 부위별 대사체의 다변량분석 2차 대사체의 주성분분석을 통하여 신선초의 4가지 부위별 양상을 분석하였다. 통계분석은 16개의 대사체 피이크, 각 피이크들의 면적 및 4가지 부위에서 추출된 시료로 실시하였다. Loading plot은 각 대사체를 4개의 그룹으로 구분 지었다; 그룹 1 (xanthoangelol, 4-hydroxyderricin, imperatorin, isolaserpin, isobavachalcone), 그룹 2 (pteryxin, laserpitin, xanthonagelol B, selinidin), 그룹 3 (isopimpinellin, bergapten, isopsoralen), 그룹 4 (demethylsuberosin, psoralen). 예를 들면, 그룹 1은 뿌리껍질과 뿌리 속을 결정짓는 주요 대사체로 확인되었으며, 그룹 3은 잎과 줄기의 대사체를 결정짓는 요인으로 확인되었다. 4) 신선초의 xanthine oxidase 활성 평가 신선초의 부위별 활성 결과에서는 메탄올로 추출된 뿌리 껍질이 높은 xanthine oxidase 저해활성 (40%, 200 ug/ml)이 관찰되었고, 대사체별 활성 연구 결과 5종의 chalcone계 화합물이 선도화합물로 확인되었다. 이들은 xanthine oxidase에 대해 농도 의존적인 저해활성 (IC50s = 8.1 – 54.3 uM)을 나타내는 대사체임을 확인하였다. 이들의 저해모드 양상 실험결과 Vmax가 감소하고 Km이 증가하는 전형적인 mixed-type 저해 양상을 나타내었고, Lineweaver-Burk plot을 재도식화하여 KIS와 KI 상수를 비교한 결과 KIS가 KI보다 높게 나타나는 mixed type I 저해제임을 확인하였다. 요약하면, 신선초 부위별 2차대사체에 대한 전체적인 프로파일링 연구를 위해 신선초 뿌리로부터 주요활성 대사체인 coumarin과 chalcone 계열화합물 16종을 분리, 정제 및 구조 동정하였다. LC-ESI-MS/MS기기를 이용하여 각 대사체를 동시에 정성 및 정량 하는 MRM 분석법을 설정하였고, 이들의 부위별 대사체의 함량을 확인한 후, 분석된 함량 결과의 유의성과 부위별 대사체 변화 패턴을 PCA로 확인하였다. 또한 신선초에서 지금까지 보고되지 않았던 xanthine oxidase 저해활성을 관찰하고, 이들의 활성 대사체가 chalcone 계열화합물임을 밝혔다.
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