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생체 시료 내 콜레스테롤 및 27-하이드록시콜레스테롤의 비정상적 대사는 심혈관계 질환을 포함하는 수많은 내분비질환을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 최근 이러한 병리 상태와의 명확한 연관성을 규명하고자, 생체시료 내 콜레스테롤과 27-하이드록시콜레스테롤의 high-throughput screening이 요구되고 있다. 따라서 본 연구에서는 빠른 분석이 가능한 매트릭스 ...

생체 시료 내 콜레스테롤 및 27-하이드록시콜레스테롤의 비정상적 대사는 심혈관계 질환을 포함하는 수많은 내분비질환을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 최근 이러한 병리 상태와의 명확한 연관성을 규명하고자, 생체시료 내 콜레스테롤과 27-하이드록시콜레스테롤의 high-throughput screening이 요구되고 있다. 따라서 본 연구에서는 빠른 분석이 가능한 매트릭스 레이져 탈착/이온화 질량분석법(matrix-assisted laser desorption ionization-tandem mass spectrometry; MALDI-MS/MS)을 이용한 고효율 스크리닝 방법을 구축하고자 MALDI 매트릭스와 생체 시료에서 발생하는 수 많은 분석 방해 물질을 최소화시키기 위하여 화학적 유도체, 고체상 추출법, MALDI 매트릭스와 같은 시료전처리 방법을 최적화 하였다. 낮은 분자량 범위에서의 매트릭스 방해 효과를 피하고 선택성이 좋은 tendem MS를 적용할 때 많은 조각이온들이 형성되어 감도가 낮아지는 것을 해결하기 위하여 스테로이드의 수산화기를 유도체화 하는 댄실화 반응(dansylation)을 도입 하였다. 또한 혈청 시료 내에 존재하는 수많은 인지질들은 낮은 분자량 범위에서 잡음으로 작용하여 MALDI-MS 분석에서 대사체의 분석 효율을 감소시키므로, 카트리지 표면에 인지질을 흡착시켜 제거할 수 있는 하이브리드 고체상 추출법(protein-precipitation hybrid solid-phase extraction; hybrid-PPT SPE)을 적용하여 혈청 시료 내의 매트릭스 효과를 감소시키고자 하였다. 또한 콜레스테롤 분석에 적합하면서 재현성 있는 분석을 위해 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)와 2,5-dihydroxy benzoic acid (DHB)를 이용하여 MALDI 매트릭스를 최적화시켰다.최적화된 실험방법으로 유효성을 측정한 결과, 0.99 이상의 직선성과 함께 콜레스테롤의 정량한계는 200 ？g/mL, 27-하이드록시콜레스테롤의 정량한계는 20 ？g/mL로 나타났으며, 추출효율은 83.7 - 106.2%, 재현성은 1.1 - 25.6%, 정확성은 87.4 - 116.9% 로 나타났다. 유효성이 검증된 MALDI-MS/MS는 고콜레스테롤혈증 토끼의 혈청 시료에 적용하였으며, 그 결과를 기존 방법인 GC-MS를 이용한 정량 결과와 비교하여 87 - 95%의 콜레스테롤 측정값을 보여 안정적인 콜레스테롤 검출을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 확립한 MALDI-MS/MS 분석방법은 실제 고콜레스테롤혈증 임상 시료의 콜레스테롤 분석에서 high-throughput screening 방법으로 사용될 수 있을 것이다.

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