본 연구는 남성 측 불임을 치료하기 위한 필수적인 수단인 정원줄기세포의 장기간 보존에 있어서 항산화제 및 세포자연사 억제제의 첨가를 통한 최적의 정원줄기세포 동결 보존 기법을 개발하기 위하여 실시하였다. 본 실험에서 사용된 정원줄기세포는 생후 6~8일령의 수컷 C57BL/6-TgEGFP (C57GFP) 생쥐의 정소로부터 회수하였으며, magnetic activated cell ...
본 연구는 남성 측 불임을 치료하기 위한 필수적인 수단인 정원줄기세포의 장기간 보존에 있어서 항산화제 및 세포자연사 억제제의 첨가를 통한 최적의 정원줄기세포 동결 보존 기법을 개발하기 위하여 실시하였다. 본 실험에서 사용된 정원줄기세포는 생후 6~8일령의 수컷 C57BL/6-TgEGFP (C57GFP) 생쥐의 정소로부터 회수하였으며, magnetic activated cell sorting (MACS) 기법을 통하여 순수도가 증진된 정원줄기세포를 획득하였다. 회수된 정원줄기세포를 각각의 항산화제(Ascorbic acid, Glutathione, Hypotaurine, Glutathione peroxidase, Catalase) 및 세포자연사 억제제 Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-DL-Asp-fluromethylketone (Z-VAD-fmk), Trans-f-[(1R)-aminoethyl]-N-4-pyridinyl cyclohexanecar–boxamide dihydrochloride (Y-27632)]를 10% fetal bovine serum (FBS)와 10% dimethyl sulfoxide (DMSO)가 첨가된 동결 보존 첨가제와 함께 –196℃에서 한 달 동안 동결 보존하였다. 정원줄기세포의 동결 보존 효율을 평가하기 위하여 융해 후 회수율과 증식 능력 그리고 미토콘드리아의 활성 정도를 확인하였다. 그 결과, 회수율은 모든 처리군에서 유의적인 차이가 나타나지 않았지만, Hypotaurine 14mM 첨가시 정원줄기세포의 체외 증식 능력(157.5 ± 12.4%)과 미토콘드리아 활성도(128.0 ± 4.9%)가 유의적으로 증가하였다. 또한, Trehalose 200 mM와 Hypotaurine 14 mM, Z-VAD-fmk 15 μM를 각각 복합적으로 첨가하여 정원줄기세포의 동결 보존 효율에 미치는 영향을 조사하였다. 결과적으로 정원줄기세포의 체외 증식 능력에 있어서는 복합 처리군에서 대조군과 비교하여 유의적으로 높은 체외 증식율을 나타내었지만, Trehalose 200 mM 처리군과 비교하여 유의적인 상승효과는 나타나지 않았다. FBS의 대체제로서 KSR과 Sericin을 첨가하여 무혈청 조건에서 정원줄기세포의 동결 보존 효율을 확인한 결과, KSR과 Sericin의 첨가는 FBS가 첨가된 대조군과 비교하여 동결-융해 후 정원줄기세포의 회수율 및 체외 증식 능력에 있어서 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 또한, Hypotaurine과 함께 첨가하여 추가적인 상승효과를 확인한 결과, KSR과 Sericin을 사용한 무혈청 조건의 Hypotaurine 14 mM의 첨가군 모두에서 동결-융해 후 정원줄기세포의 회수율에서는 유의적 차이를 나타내지 않았다. 반면에 10%, 20% KSR을 사용한 무혈청 조건의 Hypotaurine 14 mM 처리에서 혈청을 사용하였을 때와 유사하게 대조군에 비해 유의적으로 높은 정원줄기세포의 체외 증식 능력을 나타내었다(각각 161.8 ± 4.3%, 165.8 ± 14.8%, 145.3 ± 10.9%). 본 연구의 결과를 종합적으로 고려해 볼 때, 기본 동결 보존액(각각 10% DMSO와 FBS가 첨가된 DPBS)에 Hypotaurine 14mM가 정원줄기세포의 동결 보존을 위한 최적의 조건임을 확인 할 수 있었다. 또한, 동물유래 혈청인 FBS의 대체제로 임상적용에 적합한 무혈청 조건으로서 KSR을 사용하여 정원줄기세포의 효율적인 동결 보존이 가능함을 검증하였다. 따라서 본 연구의 결과는 정원줄기세포의 임상적용을 위한 기술 개발에 기초자료가 될 것으로 기대되며, 향 후 인간을 포함한 다양한 포유동물의 남성불임 치료와 생식세포의 연구를 위한 정원줄기세포의 효과적인 장기간 보존기술 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구는 남성 측 불임을 치료하기 위한 필수적인 수단인 정원줄기세포의 장기간 보존에 있어서 항산화제 및 세포자연사 억제제의 첨가를 통한 최적의 정원줄기세포 동결 보존 기법을 개발하기 위하여 실시하였다. 본 실험에서 사용된 정원줄기세포는 생후 6~8일령의 수컷 C57BL/6-TgEGFP (C57GFP) 생쥐의 정소로부터 회수하였으며, magnetic activated cell sorting (MACS) 기법을 통하여 순수도가 증진된 정원줄기세포를 획득하였다. 회수된 정원줄기세포를 각각의 항산화제(Ascorbic acid, Glutathione, Hypotaurine, Glutathione peroxidase, Catalase) 및 세포자연사 억제제 Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-DL-Asp-fluromethylketone (Z-VAD-fmk), Trans-f-[(1R)-aminoethyl]-N-4-pyridinyl cyclohexanecar–boxamide dihydrochloride (Y-27632)]를 10% fetal bovine serum (FBS)와 10% dimethyl sulfoxide (DMSO)가 첨가된 동결 보존 첨가제와 함께 –196℃에서 한 달 동안 동결 보존하였다. 정원줄기세포의 동결 보존 효율을 평가하기 위하여 융해 후 회수율과 증식 능력 그리고 미토콘드리아의 활성 정도를 확인하였다. 그 결과, 회수율은 모든 처리군에서 유의적인 차이가 나타나지 않았지만, Hypotaurine 14mM 첨가시 정원줄기세포의 체외 증식 능력(157.5 ± 12.4%)과 미토콘드리아 활성도(128.0 ± 4.9%)가 유의적으로 증가하였다. 또한, Trehalose 200 mM와 Hypotaurine 14 mM, Z-VAD-fmk 15 μM를 각각 복합적으로 첨가하여 정원줄기세포의 동결 보존 효율에 미치는 영향을 조사하였다. 결과적으로 정원줄기세포의 체외 증식 능력에 있어서는 복합 처리군에서 대조군과 비교하여 유의적으로 높은 체외 증식율을 나타내었지만, Trehalose 200 mM 처리군과 비교하여 유의적인 상승효과는 나타나지 않았다. FBS의 대체제로서 KSR과 Sericin을 첨가하여 무혈청 조건에서 정원줄기세포의 동결 보존 효율을 확인한 결과, KSR과 Sericin의 첨가는 FBS가 첨가된 대조군과 비교하여 동결-융해 후 정원줄기세포의 회수율 및 체외 증식 능력에 있어서 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 또한, Hypotaurine과 함께 첨가하여 추가적인 상승효과를 확인한 결과, KSR과 Sericin을 사용한 무혈청 조건의 Hypotaurine 14 mM의 첨가군 모두에서 동결-융해 후 정원줄기세포의 회수율에서는 유의적 차이를 나타내지 않았다. 반면에 10%, 20% KSR을 사용한 무혈청 조건의 Hypotaurine 14 mM 처리에서 혈청을 사용하였을 때와 유사하게 대조군에 비해 유의적으로 높은 정원줄기세포의 체외 증식 능력을 나타내었다(각각 161.8 ± 4.3%, 165.8 ± 14.8%, 145.3 ± 10.9%). 본 연구의 결과를 종합적으로 고려해 볼 때, 기본 동결 보존액(각각 10% DMSO와 FBS가 첨가된 DPBS)에 Hypotaurine 14mM가 정원줄기세포의 동결 보존을 위한 최적의 조건임을 확인 할 수 있었다. 또한, 동물유래 혈청인 FBS의 대체제로 임상적용에 적합한 무혈청 조건으로서 KSR을 사용하여 정원줄기세포의 효율적인 동결 보존이 가능함을 검증하였다. 따라서 본 연구의 결과는 정원줄기세포의 임상적용을 위한 기술 개발에 기초자료가 될 것으로 기대되며, 향 후 인간을 포함한 다양한 포유동물의 남성불임 치료와 생식세포의 연구를 위한 정원줄기세포의 효과적인 장기간 보존기술 개발에 크게 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
Spermatogonial stem cells(SSCs) are need to long-term preservation as the essential means to treat male infertility. Therefore, it was conducted to develop the optimal cryopreservation protocol of SSCs using antioxidants and apoptosis inhibitor in freezing medium. SSCs used in this study are iso...
Spermatogonial stem cells(SSCs) are need to long-term preservation as the essential means to treat male infertility. Therefore, it was conducted to develop the optimal cryopreservation protocol of SSCs using antioxidants and apoptosis inhibitor in freezing medium. SSCs used in this study are isolated from testes of 6-8 day old male C57BL/6-TgEGFP (C57GFP) mice and it was purified via magnetic activated cell sorting (MACS) technique. The obtained SSCs were frozen in freezing medium containing of 10% fetal bovine serum (FBS) and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) with each antioxidants (Ascorbic acid, Glutathione, Hypotaurine, Glutathione peroxidase, Catalase) or apoptosis inhibitors [Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-DL-Asp-fluromethylketone (Z-VAD-fmk), Trans-f-[(1R)-aminoethyl]-N-4-pyridinyl cyclohex anecar–boxamide dihydrochloride (Y-27632)] at –196℃ for a month. To evaluate the efficiency of cryopreservation it determined the recovery rate, proliferation capacity and mitochondrial activity after freezing-thawing. As a result, recovery rate had no significant differences among the all treated group but freezing in Hypotaurine 14 mM had significantly greater proliferation potential (157.5 ± 12.4%) and mitochondrial activity (128.0 ± 4.9%). In addition, we investigated that each compositive addition of Trehalose 200 mM, Hypotaurine 14 mM and Z-VAD-fmk 15 μM in freezing medium had an effect on cryopreservation of SSCs. Although combination group had significantly greater proliferation rate, it did not show synergistic effect compared to supplementation of freezing medium with Trehalose 200 mM. As a result of confirming the cryopreservation efficiency of SSCs using KSR and Sericin as alternatives of FBS in serum-free condition, KSR and Sericin freezing medium are no statistically significant difference in recovery and proliferation rate compared to control. Furthermore, we identify synergistic effect with Hypotaurine in serum-free condition. Although Hypotaurine 14 mM treatment group in serum-free condition was no significant difference, Hypotaurine 14 mM with 10, 20% KSR increased proliferation rate similar to Hypotaurine 14 mM consisting of 10% FBS (161.8 ± 4.3%, 165.8 ± 14.8%, 145.3 ± 10.9%, respectively). The present study demonstrated that supplementation of freezing medium with Hypotaurine 14 mM containing 10% DMSO and 10% FBS improved the efficiency for long-term cryopreservation of SSCs. These findings raise the possibility of KSR as serum replacement to clinical trial in serum-free condition. Collectively, our study opens the possibility to develop the optimal technique for long-term preservation of SSCs.
Spermatogonial stem cells(SSCs) are need to long-term preservation as the essential means to treat male infertility. Therefore, it was conducted to develop the optimal cryopreservation protocol of SSCs using antioxidants and apoptosis inhibitor in freezing medium. SSCs used in this study are isolated from testes of 6-8 day old male C57BL/6-TgEGFP (C57GFP) mice and it was purified via magnetic activated cell sorting (MACS) technique. The obtained SSCs were frozen in freezing medium containing of 10% fetal bovine serum (FBS) and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) with each antioxidants (Ascorbic acid, Glutathione, Hypotaurine, Glutathione peroxidase, Catalase) or apoptosis inhibitors [Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-DL-Asp-fluromethylketone (Z-VAD-fmk), Trans-f-[(1R)-aminoethyl]-N-4-pyridinyl cyclohex anecar–boxamide dihydrochloride (Y-27632)] at –196℃ for a month. To evaluate the efficiency of cryopreservation it determined the recovery rate, proliferation capacity and mitochondrial activity after freezing-thawing. As a result, recovery rate had no significant differences among the all treated group but freezing in Hypotaurine 14 mM had significantly greater proliferation potential (157.5 ± 12.4%) and mitochondrial activity (128.0 ± 4.9%). In addition, we investigated that each compositive addition of Trehalose 200 mM, Hypotaurine 14 mM and Z-VAD-fmk 15 μM in freezing medium had an effect on cryopreservation of SSCs. Although combination group had significantly greater proliferation rate, it did not show synergistic effect compared to supplementation of freezing medium with Trehalose 200 mM. As a result of confirming the cryopreservation efficiency of SSCs using KSR and Sericin as alternatives of FBS in serum-free condition, KSR and Sericin freezing medium are no statistically significant difference in recovery and proliferation rate compared to control. Furthermore, we identify synergistic effect with Hypotaurine in serum-free condition. Although Hypotaurine 14 mM treatment group in serum-free condition was no significant difference, Hypotaurine 14 mM with 10, 20% KSR increased proliferation rate similar to Hypotaurine 14 mM consisting of 10% FBS (161.8 ± 4.3%, 165.8 ± 14.8%, 145.3 ± 10.9%, respectively). The present study demonstrated that supplementation of freezing medium with Hypotaurine 14 mM containing 10% DMSO and 10% FBS improved the efficiency for long-term cryopreservation of SSCs. These findings raise the possibility of KSR as serum replacement to clinical trial in serum-free condition. Collectively, our study opens the possibility to develop the optimal technique for long-term preservation of SSCs.
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