이종 간 장기이식은 세포나 조직 및 기관을 다른 종에 이식하는 것으로, 국내외적으로 급격히 증가하는 이식 대기환자에 비해 부족한 장기 이식 문제를 해결할 대안으로 기대되고 있다. 돼지는 장기의 크기가 인간과 유사하며, 무균 상태에서 사육할 수 있고, 다산성이며 가격이 저렴한 점 등의 이유로 이종 간 이식용 장기의 제공원으로 주목받고 있다. 그러나 돼지 세포에서 생산되는 돼지 ...
이종 간 장기이식은 세포나 조직 및 기관을 다른 종에 이식하는 것으로, 국내외적으로 급격히 증가하는 이식 대기환자에 비해 부족한 장기 이식 문제를 해결할 대안으로 기대되고 있다. 돼지는 장기의 크기가 인간과 유사하며, 무균 상태에서 사육할 수 있고, 다산성이며 가격이 저렴한 점 등의 이유로 이종 간 이식용 장기의 제공원으로 주목받고 있다. 그러나 돼지 세포에서 생산되는 돼지 내인성레트로바이러스(Porcine endogenous retrovirus, PERV)로 인해 잠재적인 위험성을 갖는다. 유전자 전달 및 암 치료를 목적으로 할 때 Murine leukemia virus(MLV) 벡터는 좋은 재료 중 하나로 여겨진다. MLV를 포함하는 레트로바이러스는 분열하는 세포에만 감염된다는 등의 특징을 가지고 있어 암을 치료하는 벡터로서 활발히 연구 중이다. 이러한 벡터에 사용되는 대표적인 유전자는 전구 약물 활성 유전자인 cytosine deaminase(CD) 유전자이다. CD 유전자는 세포 내에서 전구 약물인 5-fluorocytosine (5-FC)을 5-fluorouracil(5-FU)로 바꿔 암세포를 파괴한다. 인체 내에는 바이러스를 막는 여러 가지 인자를 가지고 있다. 이 인자 중 대표적인 것이 apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide(APOBEC)이다. APOBEC 유전자는 CD와 유사하게 바이러스를 탈 아미노화시키는 것이 보고되어있다. 본 연구의 목적은 PERV를 생물학적으로 이해하고, 유전자 전달용 벡터 개발과 항암 바이러스로 사용하기 위해 복제 가능한 벡터로 개발하고자 한다. 본 연구에서 벡터로 개발 예정인 PERV는 A, B, C로 분류되는데, PERV A와 PERV B 그리고 재조합된 PERV C/A가 인간 세포를 감염할 수 있다. 먼저, PERV를 생산하는 세포주인 293T-PERV, PK-15, MPK에서 3가지 타입의 PERV를 얻었다. PERV는 기본적으로 낮은 역가를 갖는데, 역가를 높이기 위하여 cytomegalovirus (CMV)의 프로모터를 삽입하여 비교하였다. CMV 프로모터가 첨가된 클론들에 GFP을 삽입하여 바이러스 발현을 확인하였다. 모든 클론 중 CMV 프로모터를 가진 PERV-A 클론(CMV-PERV-A)에서 가장 높은 전사율을 확인하였다. 역가를 높이기 위한 다른 방법으로 PERV-A의 env 유전자를 PERV-C에 재조합하였다. 재조합된 클론은 GFP 유전자를 삽입하여 바이러스 발현을 확인했다. 재조합 클론들은 야생형 클론에 비해 전사량이 2~13배 높았고, 야생형을 포함한 모든 클론은 인간 A549 세포에서 높은 감염률을 확인할 수 있었다. 또한 암 치료에 사용되는 CD 유전자의 기능을 APOBEC 유전자도 가지고 있다고 보고되어있다. 따라서 CD 유전자 대신 APOBEC 유전자를 이용하여 항암 효과를 확인하였다. APOBEC를 사용한 MLV 벡터들은 5-FC를 5-FU로 바꿔 세포를 파괴하였다. 또한 MLV 벡터를 사용하였을때 APOBEC에 의한 항암효과와 동시에 APOBEC이 벡터를 저해하였다. 따라서 본 연구를 통하여 레트로바이러스의 문제점인 낮은 바이러스 역가를 증대시킬 수 있는 방법과 벡터의 안정성을 높일 수 있는 기작을 찾았다.
이종 간 장기이식은 세포나 조직 및 기관을 다른 종에 이식하는 것으로, 국내외적으로 급격히 증가하는 이식 대기환자에 비해 부족한 장기 이식 문제를 해결할 대안으로 기대되고 있다. 돼지는 장기의 크기가 인간과 유사하며, 무균 상태에서 사육할 수 있고, 다산성이며 가격이 저렴한 점 등의 이유로 이종 간 이식용 장기의 제공원으로 주목받고 있다. 그러나 돼지 세포에서 생산되는 돼지 내인성 레트로바이러스(Porcine endogenous retrovirus, PERV)로 인해 잠재적인 위험성을 갖는다. 유전자 전달 및 암 치료를 목적으로 할 때 Murine leukemia virus(MLV) 벡터는 좋은 재료 중 하나로 여겨진다. MLV를 포함하는 레트로바이러스는 분열하는 세포에만 감염된다는 등의 특징을 가지고 있어 암을 치료하는 벡터로서 활발히 연구 중이다. 이러한 벡터에 사용되는 대표적인 유전자는 전구 약물 활성 유전자인 cytosine deaminase(CD) 유전자이다. CD 유전자는 세포 내에서 전구 약물인 5-fluorocytosine (5-FC)을 5-fluorouracil(5-FU)로 바꿔 암세포를 파괴한다. 인체 내에는 바이러스를 막는 여러 가지 인자를 가지고 있다. 이 인자 중 대표적인 것이 apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide(APOBEC)이다. APOBEC 유전자는 CD와 유사하게 바이러스를 탈 아미노화시키는 것이 보고되어있다. 본 연구의 목적은 PERV를 생물학적으로 이해하고, 유전자 전달용 벡터 개발과 항암 바이러스로 사용하기 위해 복제 가능한 벡터로 개발하고자 한다. 본 연구에서 벡터로 개발 예정인 PERV는 A, B, C로 분류되는데, PERV A와 PERV B 그리고 재조합된 PERV C/A가 인간 세포를 감염할 수 있다. 먼저, PERV를 생산하는 세포주인 293T-PERV, PK-15, MPK에서 3가지 타입의 PERV를 얻었다. PERV는 기본적으로 낮은 역가를 갖는데, 역가를 높이기 위하여 cytomegalovirus (CMV)의 프로모터를 삽입하여 비교하였다. CMV 프로모터가 첨가된 클론들에 GFP을 삽입하여 바이러스 발현을 확인하였다. 모든 클론 중 CMV 프로모터를 가진 PERV-A 클론(CMV-PERV-A)에서 가장 높은 전사율을 확인하였다. 역가를 높이기 위한 다른 방법으로 PERV-A의 env 유전자를 PERV-C에 재조합하였다. 재조합된 클론은 GFP 유전자를 삽입하여 바이러스 발현을 확인했다. 재조합 클론들은 야생형 클론에 비해 전사량이 2~13배 높았고, 야생형을 포함한 모든 클론은 인간 A549 세포에서 높은 감염률을 확인할 수 있었다. 또한 암 치료에 사용되는 CD 유전자의 기능을 APOBEC 유전자도 가지고 있다고 보고되어있다. 따라서 CD 유전자 대신 APOBEC 유전자를 이용하여 항암 효과를 확인하였다. APOBEC를 사용한 MLV 벡터들은 5-FC를 5-FU로 바꿔 세포를 파괴하였다. 또한 MLV 벡터를 사용하였을때 APOBEC에 의한 항암효과와 동시에 APOBEC이 벡터를 저해하였다. 따라서 본 연구를 통하여 레트로바이러스의 문제점인 낮은 바이러스 역가를 증대시킬 수 있는 방법과 벡터의 안정성을 높일 수 있는 기작을 찾았다.
Xenotransplantation is to transplant cells or tissues or organs from one to another specie; thus, it is expected to become an alternative to solve the problem of the shortage of internal organ transplants compared to the number of patients waiting for transplant, which has been drastically increasin...
Xenotransplantation is to transplant cells or tissues or organs from one to another specie; thus, it is expected to become an alternative to solve the problem of the shortage of internal organ transplants compared to the number of patients waiting for transplant, which has been drastically increasing at home and abroad. The size of the organs of pigs are compatible with humans, and they may be bred under aseptic conditions and they are early sexual maturity, short gestational period, large litter size of between 6-16 piglets and cheap; thereby, getting attention as a source of organs for xenotransplantation. But following the discovery that porcine endogenous retrovirus (PERV) can infect human cells, the potential risk of a zoonotic infection by PERV has been a major obstacle in the xenotransplantation field. Recombinant murine leukemia virus-based retroviral vectors have been extensiviely developed for use in gene therapy. The specific targeting of dividing cells with murine leukemia virus (MLV) vectors provides an excellent opportunity for cancer gene therapy compared to other types of vector. Engineered to carry an exogenous, prodrug-activating transgene. The transgene, also known as the prodrug-sensitive gene, can encode an enzyme that converts nontoxic prodrugs into toxic products (or cytotoxic factor) to kill tumor cells. Retroviral restriction factors, APOBEC enzymes are well characterized for their ability to deamination cytosine to uracil. The aim of this thesis is to gain a better understanding of PERV biology, so as to Development of retroviral replicating vectors for use as gene transfer and anticancer agents. Three subgroups of PERV, PERV-A, -B, and -C, have been identified. Either, PERV-A and PERV-B or viruses derived from recombination events between PERV-A and PERV-C, are able to result in productive infection of human cells in vitro, such as the kidney epithelial 293 cell line. First, in this study PERVs were cloned from RNA of PERV-producing human cells, 293T-PERV and pig cell, PK15 and MPK. The amplified and three types of homologous and heterologous clones were constructed. PERV produce at a low level of virions. Therefore, PERV clone was transferred to a vector using CMV promoter. The clone using CMV promoter was inserted GFP for a indicator. 293T cells were transfected with RNA clones that using LTR promoter and CMV promoter. Expression of GFP was similar to both cells. The PERV-A clone using CMV promoter is high level of transcription activity. Except for env gene, of PERV-A, the recombinant of PERV-C was determined to replication efficiency. The recombinant clone was inserted GFP for a indicator. The recombinant PERV clone is high level of transcription activity. Either, all clones have been shown to high infect both human A549 cells. Also, we use a APOBEC enzyme instead of CD gene. Amphotropic murine leukemia viral vector encoding that converts the prodrug 5-fluorocytosine (5-FC) to the potent anticancer drug, 5-fluorouracil (5-FU) in an infected tumor. We use APOBEC enzyme instead of Cytosine deaminase (CD) gene. Amphotropic murine leukemia viral vector encoding that converts the prodrug 5-fluorocytosine(5-FC) to the potent anticancer drug, 5-fluorouracil(5-FU) in an infected tumor. Moreover, we will supplement developed vector system. It removes the risk potential of the existing retroviral vectors.
Xenotransplantation is to transplant cells or tissues or organs from one to another specie; thus, it is expected to become an alternative to solve the problem of the shortage of internal organ transplants compared to the number of patients waiting for transplant, which has been drastically increasing at home and abroad. The size of the organs of pigs are compatible with humans, and they may be bred under aseptic conditions and they are early sexual maturity, short gestational period, large litter size of between 6-16 piglets and cheap; thereby, getting attention as a source of organs for xenotransplantation. But following the discovery that porcine endogenous retrovirus (PERV) can infect human cells, the potential risk of a zoonotic infection by PERV has been a major obstacle in the xenotransplantation field. Recombinant murine leukemia virus-based retroviral vectors have been extensiviely developed for use in gene therapy. The specific targeting of dividing cells with murine leukemia virus (MLV) vectors provides an excellent opportunity for cancer gene therapy compared to other types of vector. Engineered to carry an exogenous, prodrug-activating transgene. The transgene, also known as the prodrug-sensitive gene, can encode an enzyme that converts nontoxic prodrugs into toxic products (or cytotoxic factor) to kill tumor cells. Retroviral restriction factors, APOBEC enzymes are well characterized for their ability to deamination cytosine to uracil. The aim of this thesis is to gain a better understanding of PERV biology, so as to Development of retroviral replicating vectors for use as gene transfer and anticancer agents. Three subgroups of PERV, PERV-A, -B, and -C, have been identified. Either, PERV-A and PERV-B or viruses derived from recombination events between PERV-A and PERV-C, are able to result in productive infection of human cells in vitro, such as the kidney epithelial 293 cell line. First, in this study PERVs were cloned from RNA of PERV-producing human cells, 293T-PERV and pig cell, PK15 and MPK. The amplified and three types of homologous and heterologous clones were constructed. PERV produce at a low level of virions. Therefore, PERV clone was transferred to a vector using CMV promoter. The clone using CMV promoter was inserted GFP for a indicator. 293T cells were transfected with RNA clones that using LTR promoter and CMV promoter. Expression of GFP was similar to both cells. The PERV-A clone using CMV promoter is high level of transcription activity. Except for env gene, of PERV-A, the recombinant of PERV-C was determined to replication efficiency. The recombinant clone was inserted GFP for a indicator. The recombinant PERV clone is high level of transcription activity. Either, all clones have been shown to high infect both human A549 cells. Also, we use a APOBEC enzyme instead of CD gene. Amphotropic murine leukemia viral vector encoding that converts the prodrug 5-fluorocytosine (5-FC) to the potent anticancer drug, 5-fluorouracil (5-FU) in an infected tumor. We use APOBEC enzyme instead of Cytosine deaminase (CD) gene. Amphotropic murine leukemia viral vector encoding that converts the prodrug 5-fluorocytosine(5-FC) to the potent anticancer drug, 5-fluorouracil(5-FU) in an infected tumor. Moreover, we will supplement developed vector system. It removes the risk potential of the existing retroviral vectors.
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