초록 ▼

○ 레트로바이러스는 감염 후 숙주세포의 유전자에 삽입되는 특성 때문에 주로 지속적인 발현이 요구되거나 유전병 등 치료에 사용되고 있지만 바이러스 감염 및 배양과정에서 숙주세포의 핵형변화에 따른 종양 가능성을 배제할 수 없으므로 유전자치료제에 대한 숙주세포의 핵형변화 분석이 필요함. 본 연구에서는 MLV와 lentivirus를 이용한 유전자치료제에서 바이러스벡터의 감염역가, 감염횟수 및 숙주세포의 배양 조건, 배양 기간 등 여러 가지 환경 변화에 따른 숙주세포의 핵형 변화와 상관관계를 파악함으로써 유전자치료제 평가기술 및 시험법을 확

○ 레트로바이러스는 감염 후 숙주세포의 유전자에 삽입되는 특성 때문에 주로 지속적인 발현이 요구되거나 유전병 등 치료에 사용되고 있지만 바이러스 감염 및 배양과정에서 숙주세포의 핵형변화에 따른 종양 가능성을 배제할 수 없으므로 유전자치료제에 대한 숙주세포의 핵형변화 분석이 필요함. 본 연구에서는 MLV와 lentivirus를 이용한 유전자치료제에서 바이러스벡터의 감염역가, 감염횟수 및 숙주세포의 배양 조건, 배양 기간 등 여러 가지 환경 변화에 따른 숙주세포의 핵형 변화와 상관관계를 파악함으로써 유전자치료제 평가기술 및 시험법을 확립하고자함.
○ 유전자치료용 MLV 및 Lenti 유래 retroviral vector의 감염을 확인하기 위하여 MLV 유래 retroviral vector로는 pBabe-puro와 pMX vector를 선정한 후 GFP를 cloning하여 pBabe-puro-GFP, pMX-FIG plasmid를 제조함. 또한 Lenti 유래 retroviral vector로는 pTRH-mCMV-GFP와 pTRH-mCMV-Luc을 선정하고 TNF-alpha에 의해 발현을 조절하기 위하여 NF-${\kappa}B$ promoter를 cloning하여 pTRE-NF-${\kappa}B$-GFP와 pTRE-NF-${\kappa}B$-Luc plasmid를 제조함.
○ 숙주세포로는 diploid chromosome을 가지고 있는 인체세포인 MRC-5 세포를 선정하였고 MRC-5 세포주는 약 60 passage까지 정상 핵형을 유지함. MRC-5 이외에 인체 정상 세포주 들인 MCF-10A, Hs578Bst, HaKaT 세포들을 선정하여 배양함.
○ 구축된 벡터를 이용하여 packaging cell line인 amphotropic Pheonix cell과 HEK 293T cells를 이용하여 각각 MLV 유래 retroviral particle과 Lenti 유래 retroviral particle을 만듬. 이 retorviral particle을 숙주세포에 감염시킨 후 MLV 유래 retroviral vector는 형광으로 GFP를 확인하였고 Lentiviral vector의 경우 TNF-alpha에 의해 농도와 시간 의존적으로 GFP와 Luciferase의 활성이 조절되는 것을 확임함.
○ Retroviral particle은 12시간 간격으로 두 번 이상 감염시켰고 puromycin (1.5 ${\mu}g/ml$)으로 selection한 후 희석배수를 1:3, 1:25, 1:250으로 하여 배양하며 3번의 계대배양마다 세포주를 수집하였음.
○ 각 조건별로 수집한 세포에 패한 대형 분석을 실시하였음. MRC-5 세포의 경우 colcemid를 8시간이상 처리하여 metaphase arrest를 유도하였음. 핵형분석은 Chips karyotype으로 분석함.
○ 바이러스 벡터 및 숙주세포 배양 조건과 상관관계 분석한 결과 MLV 유래 retroviral vector인 pMX-FIG의 경우 숙주세포를 25 passage에서 감염시킨 후, 20 passage 계대 배양까지는 핵형변화를 관찰하지 못하였지만 21 passage 이후에 배수체(4N) 생성하였고 같은 MLV 유래 retroviral vector인 pBabe-puro-GFP는 20 passage 까지 핵형변화를 일으키지 않고 정상 핵형을 유지하였음. 또한 Lentiviral vector의 경우 virus 감염 후 20 passage까지 핵형 변화를 유도하지 않음.
○ 이러한 결과로부터 MLV 유래 retroviral vector는 MRC-5에 감염시킨 다음 약 20 passage 경과 후 핵형을 변화시킴을 관찰하였고 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자치료제가 핵형을 변화시켜 종양을 유발할 가능성에 대한 더 많은 실험이 필요함.

Abstract ▼

Retroviral vectors with long terminal repeats (LTRs), which contain strong enhancer-promoter sequences at both ends of their genome, are widely used for stable gene transfer into target cells. However, recent clinical data and mouse models are pointing to insertional activation of cellular proto-onc

Retroviral vectors with long terminal repeats (LTRs), which contain strong enhancer-promoter sequences at both ends of their genome, are widely used for stable gene transfer into target cells. However, recent clinical data and mouse models are pointing to insertional activation of cellular proto-oncogenes as a dose-limiting side effect of retroviral gene delivery, potentially inducing leukemia. This study concerns the cytogenetic stability of murine leukaemia virus (MLV)-based retroviral vectors and FIV-based lentiviral vectors in primary culture and after passaging. Primary human fibroblasts were infected retroviral particle from amphotropic phoenix cell transfected with the plasmids pBabepuro-GFP, pMX-FIG or pSuper and MRC-5 were infected viral particle from 293T cells transfected with the plasmids pTRE-NF-kB-GFP, pFIV-34N and pVSV-G. After puromycin selection, chromosome preparations from primary MRC-5 cultures and after 3 passages were analyzed by conventional staining and G-banding techniques. MLV-based pMX-GFP infected MRC-5 cells showed polyploid karyotypes, 4N(96) and other MLV-based pBabepuro-GFP and lentiviral based retroviral vector infected MRC-5 cells showd normal dipolid karyotypes, 2N(46), without aneuploidy or polyploidy; chromosome structural abnormalities were not detected until 24 passages. The results indicate that the MLV based retrovirus vector (pMX-GFP) infected normal cells changed polyploid karyotype and lentiviral vector infected normal cells retained normal cytogenetics. However, given the limited level of sophistication of the current approach, the data suggest that MLV and Lenti based retroviral vectors may present a detectable cytogenetic instability and more appropriate testing strategies are needed to evaluate the nature of the risk.

목차 Contents

• 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
• 제출문 ...2
• 목차 ...3
• I. 연구개발결과 요약문 ...4
• 연구결과보고서 요약문 ...5
• Summary ...7
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...9
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...21
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과...28
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...36
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과...38
• 제6장 기타 중요변경사항...39
• 제7장 참고문헌...39
• 제8장 첨부서류...42
• III. 제 1 세부연구개발과제 연구결과...70
• 제1장 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...71
• 제2장 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...84
• 제3장 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과...88
• 제4장 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...94
• 제5장 제 1 세부연구개발과제의 연구성과...95
• 제6장 기타 중요변경사항...96
• 제7장 참고문헌...96
• 제8장 첨부서류...98
• IV. 제 2 세부연구개발과제 연구결과...100
• 제1장 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...101
• 제2장 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...113
• 제3장 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과...118
• 제4장 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...124
• 제5장 제 2 세부연구개발과제의 연구성과...126
• 제6장 기타 중요변경사항...127
• 제7장 참고문헌...127
• 제8장 첨부서류...129