기수산 윤충류(Brachionus koreanus)에서 염분 및 중금속 노출에 따른 Na+/K+ - ATPase 유전자 특성 및 단백질 활성 분석 Identification and characterization of Na+/K+ - ATPase in the monogonont rotifer Brachionus koreanus exposed to different salinity and heavy metals원문보기
지구온난화는 pH, 온도, 염분도 등 수중생태계의 많은 것을 변화시킨다. 그리고 중금속은 상위포식자에게로 농축 되면서 생태계 전반에 영향을 미치며, 수서 생물에 대한 중금속의 negative effect에 대해 많은 연구가 보고되어 왔다. 특히 중금속이 삼투조절에 영향을 미친다고 알려져 왔으며, 거의 대부분의 동물 세포에서 삼투조절은 ATPase superfamily에 속하는 Na+/K+ATPase에 의해 유지된다. 그러나 ...
지구온난화는 pH, 온도, 염분도 등 수중생태계의 많은 것을 변화시킨다. 그리고 중금속은 상위포식자에게로 농축 되면서 생태계 전반에 영향을 미치며, 수서 생물에 대한 중금속의 negative effect에 대해 많은 연구가 보고되어 왔다. 특히 중금속이 삼투조절에 영향을 미친다고 알려져 왔으며, 거의 대부분의 동물 세포에서 삼투조절은 ATPase superfamily에 속하는 Na+/K+ATPase에 의해 유지된다. 그러나 윤충류에서 Na+/K+ATPase에 대한 유전자 정보와 기능에 대한 연구는 거의 없다. 따라서 본 연구에서는 1) 기수성 요각류인 Brachionus koreanus에 대해 염분 스트레스가 개체군 성장에 미치는 영향을 분석하였고, 2) 개체 내 중금속 카드뮴과 납의 축적 여부를 확인하였으며, 3) Na+/K+ATPase 유전자의 클로닝, 염기서열 분석, 그리고 phylogenetic analysis를 통하여 유전자를 동정하였고, 마지막으로 4) 염분과 중금속에 대한 Na+/K+ATPase 효소 활성 및 유전자 발현 양상을 분석함으로써 B. koreanus 내에서 Na+/K+ATPase 효소의 기능과 중금속에 영향을 분자적 수준에서 조사하고자 하였다. 결과로서 Na+/K+ATPase 유전자는 총 3144 bp로, 3069 bp의 ORF를 가지며, 총 1,022 amino acids (a.a.) 길이의 폴리펩티드를 암호화 하는 것으로 나타났다. 이 단백질의 이론상으로 추정되는 pI 값은 5.83 이며, molecular weight (Mw)는 113.82 KDa이었다. 그리고 Conserved domain analysis 결과 Na+/K+ATPase는 Cation_ATPase_N Superfamily domain (40 – 113 aa), E1-E2 ATPase Superfamily domain (138 – 366 aa), Hydrolase_like2 Superfamily domain (427 – 520 aa), HAD_like Superfamily domain (626 – 705 aa), Cation transporting ATPase domain (798 – 1007 aa)을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 막단백질로서 membrane - spanning region이 다른 생물의 Na+/K+ATPase에서 알려진 것과 동일하게 8개의 transmembrane helics를 갖는 것을 확인하였다. 염분도 노출에 대해 15 psu와 20 psu를 제외한 hypo-와 hyper- salinity stress에 대해서는 개체군의 성장이 저해되는 것을 관찰하였다. 염분 변화에 대한 Na+/K+ATPase 효소 활성은 6 psu에서는 유의하게 증가했으나, 32 psu에서는 대조군에 비해 변화가 없었다. Na+/K+ATPase 발현량을 확인한 결과, 고 염분도에 노출된 개체의 경우 Na+/K+ATPase의 시간 의존적으로 전사량이 지속적으로 증가는 반면 저 염분도에서는 시간에 따라 전사량이 현저히 줄어들었다. 중금속 축적 실험 결과에서 카드뮴과 납이 B. koreanus 체내에 축적되는 양상을 확인하였다. 중금속에 대한 Na+/K+ATPase 효소 활성은 농도 의존적으로 유의하게 증가하였고, 유전자 발현량도 두 중금속 모두 노출 시간과 농도 의존적으로 유의하게 증가하는 양상을 보였다. 이러한 결과는 Na+/K+ATPase가 염분와 중금속에 의해 유도되는 삼투 스트레스에 대해 삼투 조절에 관여하는 것으로 보이며, 특히 납에 대해 이들 유전자의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 보아 카드뮴에 비해 납에서 민감도가 더 큰 것으로 판단된다. 본 연구 결과는 B. koreanus의 Na+/K+ATPase가 삼투 조절에 관여하며, 중금속 오염모니터링을 위한 잠재적인 분자 바이오마커로서 이용될 수 있음을 보여주고 있다. 또한, B. koreanus의 기후변화에 따른 생리학적 특성 변화 및 중금속에 대한 독성 메커니즘을 분자 수준에서 이해하는데 도움이 될 것이다.
지구온난화는 pH, 온도, 염분도 등 수중생태계의 많은 것을 변화시킨다. 그리고 중금속은 상위포식자에게로 농축 되면서 생태계 전반에 영향을 미치며, 수서 생물에 대한 중금속의 negative effect에 대해 많은 연구가 보고되어 왔다. 특히 중금속이 삼투조절에 영향을 미친다고 알려져 왔으며, 거의 대부분의 동물 세포에서 삼투조절은 ATPase superfamily에 속하는 Na+/K+ATPase에 의해 유지된다. 그러나 윤충류에서 Na+/K+ATPase에 대한 유전자 정보와 기능에 대한 연구는 거의 없다. 따라서 본 연구에서는 1) 기수성 요각류인 Brachionus koreanus에 대해 염분 스트레스가 개체군 성장에 미치는 영향을 분석하였고, 2) 개체 내 중금속 카드뮴과 납의 축적 여부를 확인하였으며, 3) Na+/K+ATPase 유전자의 클로닝, 염기서열 분석, 그리고 phylogenetic analysis를 통하여 유전자를 동정하였고, 마지막으로 4) 염분과 중금속에 대한 Na+/K+ATPase 효소 활성 및 유전자 발현 양상을 분석함으로써 B. koreanus 내에서 Na+/K+ATPase 효소의 기능과 중금속에 영향을 분자적 수준에서 조사하고자 하였다. 결과로서 Na+/K+ATPase 유전자는 총 3144 bp로, 3069 bp의 ORF를 가지며, 총 1,022 amino acids (a.a.) 길이의 폴리펩티드를 암호화 하는 것으로 나타났다. 이 단백질의 이론상으로 추정되는 pI 값은 5.83 이며, molecular weight (Mw)는 113.82 KDa이었다. 그리고 Conserved domain analysis 결과 Na+/K+ATPase는 Cation_ATPase_N Superfamily domain (40 – 113 aa), E1-E2 ATPase Superfamily domain (138 – 366 aa), Hydrolase_like2 Superfamily domain (427 – 520 aa), HAD_like Superfamily domain (626 – 705 aa), Cation transporting ATPase domain (798 – 1007 aa)을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 막단백질로서 membrane - spanning region이 다른 생물의 Na+/K+ATPase에서 알려진 것과 동일하게 8개의 transmembrane helics를 갖는 것을 확인하였다. 염분도 노출에 대해 15 psu와 20 psu를 제외한 hypo-와 hyper- salinity stress에 대해서는 개체군의 성장이 저해되는 것을 관찰하였다. 염분 변화에 대한 Na+/K+ATPase 효소 활성은 6 psu에서는 유의하게 증가했으나, 32 psu에서는 대조군에 비해 변화가 없었다. Na+/K+ATPase 발현량을 확인한 결과, 고 염분도에 노출된 개체의 경우 Na+/K+ATPase의 시간 의존적으로 전사량이 지속적으로 증가는 반면 저 염분도에서는 시간에 따라 전사량이 현저히 줄어들었다. 중금속 축적 실험 결과에서 카드뮴과 납이 B. koreanus 체내에 축적되는 양상을 확인하였다. 중금속에 대한 Na+/K+ATPase 효소 활성은 농도 의존적으로 유의하게 증가하였고, 유전자 발현량도 두 중금속 모두 노출 시간과 농도 의존적으로 유의하게 증가하는 양상을 보였다. 이러한 결과는 Na+/K+ATPase가 염분와 중금속에 의해 유도되는 삼투 스트레스에 대해 삼투 조절에 관여하는 것으로 보이며, 특히 납에 대해 이들 유전자의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 보아 카드뮴에 비해 납에서 민감도가 더 큰 것으로 판단된다. 본 연구 결과는 B. koreanus의 Na+/K+ATPase가 삼투 조절에 관여하며, 중금속 오염 모니터링을 위한 잠재적인 분자 바이오마커로서 이용될 수 있음을 보여주고 있다. 또한, B. koreanus의 기후변화에 따른 생리학적 특성 변화 및 중금속에 대한 독성 메커니즘을 분자 수준에서 이해하는데 도움이 될 것이다.
Climate change affects chemical and physical properties such as pH, temperature, and salinity in aquatic environment. Heavy metals can biomagnify to high tropical level through food web and consequently negative effects on aquatic organisms. In particular, several studies suggest that heavy metal ca...
Climate change affects chemical and physical properties such as pH, temperature, and salinity in aquatic environment. Heavy metals can biomagnify to high tropical level through food web and consequently negative effects on aquatic organisms. In particular, several studies suggest that heavy metal can disrupt osmoregulation. In animal cell, osmotic regulation is constantly maintained via sodium/ possassioum adenotriphosphase (Na+/K+-ATPase) which belongs to ATPase superfamily. However, little information on the sequence information and functions of Na+/K+-ATPase is available in the rotifer. In this study, we 1) analyzed the effects of salinity stress on population growth of brackish rotifer, Brachionus koreanus, 2) measured the accumulated level of heavy metals (cadmium and lead) in B. koreanus, 3) identified Na+/K+-ATPase gene using cloning, sequencing analysis, and phylogenetic analysis, and finally 4) investigated the effects of salinity and heavy metals on Na+/K+-ATPase enzyme activity and mRNA expression in B. koreanus. As results, full-length cDNA sequences of B. koreanus Na+/K+-ATPase alpha subunit was 3144 bp in length, which contains 3069 bp of ORF encoding a putative Na+/K+-ATPase alpha subunit of 1022 amino acid residues. Predicted theoretical pI value and molecular weight was 5.83, and 113,82 kDa, respectively. Conserved domain analysis showed that Na+/K+-ATPase had five domains as follows: Cation_ATPase_N Superfamily domain (40 – 113 aa), E1-E2 ATPase Superfamily domain (138 – 366 aa), Hydrolase_like2 Superfamily domain (427 – 520 aa), HAD_like Superfamily domain (626 – 705 aa), Cation transporting ATPase domain (798 – 1007 aa). B. koreanus Na+/K+-ATPase had same 8 transmembrane helics as observed in other species. After exposure to different salinity, population growth was inhibited in hypo- and hyper- salinity, except for 15 and 20 psu. B. koreanus Na+/K+-ATPase activity was significantly increased at 6 psu, but no change in 32 psu, compared to control (15psu). In B. koreanus exposed to hyper salinity, Na+/K+-ATPase mRNA expression was constantly elevated, whereas its level was reduced at hypo salinity in time – dependent manner. In experiment of heavy metal exposure, cadmium and lead were accumulated in B. koreanus, and a significant increase in Na+/K+-ATPase activity was observed in concentration – dependent manner. B. koreanus Na+/K+-ATPase mRNA level was also time and concentration dependently increased in both heavy meal exposed group. In particular, the expression of Na+/K+-ATPase mRNA was sensitively modulated by lead rather than cadmium. These findings suggest that Na+/K+-ATPase may be involved in ion regulation as a protective mechanism against salinity and heavy metal – induced osmotic stress. Our findings indicate that B. koreanus Na+/K+-ATPase would play a role in osmoregulation, and be a potential molecular biomarker for risk assessment of heavy metals in aquatic environment. This study will be helpful for better understanding of molecular mechanisms of heavy metals, and changes of physiological characteristics under climage changes in this species.
Climate change affects chemical and physical properties such as pH, temperature, and salinity in aquatic environment. Heavy metals can biomagnify to high tropical level through food web and consequently negative effects on aquatic organisms. In particular, several studies suggest that heavy metal can disrupt osmoregulation. In animal cell, osmotic regulation is constantly maintained via sodium/ possassioum adenotriphosphase (Na+/K+-ATPase) which belongs to ATPase superfamily. However, little information on the sequence information and functions of Na+/K+-ATPase is available in the rotifer. In this study, we 1) analyzed the effects of salinity stress on population growth of brackish rotifer, Brachionus koreanus, 2) measured the accumulated level of heavy metals (cadmium and lead) in B. koreanus, 3) identified Na+/K+-ATPase gene using cloning, sequencing analysis, and phylogenetic analysis, and finally 4) investigated the effects of salinity and heavy metals on Na+/K+-ATPase enzyme activity and mRNA expression in B. koreanus. As results, full-length cDNA sequences of B. koreanus Na+/K+-ATPase alpha subunit was 3144 bp in length, which contains 3069 bp of ORF encoding a putative Na+/K+-ATPase alpha subunit of 1022 amino acid residues. Predicted theoretical pI value and molecular weight was 5.83, and 113,82 kDa, respectively. Conserved domain analysis showed that Na+/K+-ATPase had five domains as follows: Cation_ATPase_N Superfamily domain (40 – 113 aa), E1-E2 ATPase Superfamily domain (138 – 366 aa), Hydrolase_like2 Superfamily domain (427 – 520 aa), HAD_like Superfamily domain (626 – 705 aa), Cation transporting ATPase domain (798 – 1007 aa). B. koreanus Na+/K+-ATPase had same 8 transmembrane helics as observed in other species. After exposure to different salinity, population growth was inhibited in hypo- and hyper- salinity, except for 15 and 20 psu. B. koreanus Na+/K+-ATPase activity was significantly increased at 6 psu, but no change in 32 psu, compared to control (15psu). In B. koreanus exposed to hyper salinity, Na+/K+-ATPase mRNA expression was constantly elevated, whereas its level was reduced at hypo salinity in time – dependent manner. In experiment of heavy metal exposure, cadmium and lead were accumulated in B. koreanus, and a significant increase in Na+/K+-ATPase activity was observed in concentration – dependent manner. B. koreanus Na+/K+-ATPase mRNA level was also time and concentration dependently increased in both heavy meal exposed group. In particular, the expression of Na+/K+-ATPase mRNA was sensitively modulated by lead rather than cadmium. These findings suggest that Na+/K+-ATPase may be involved in ion regulation as a protective mechanism against salinity and heavy metal – induced osmotic stress. Our findings indicate that B. koreanus Na+/K+-ATPase would play a role in osmoregulation, and be a potential molecular biomarker for risk assessment of heavy metals in aquatic environment. This study will be helpful for better understanding of molecular mechanisms of heavy metals, and changes of physiological characteristics under climage changes in this species.
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