식물을 포함한 모든 생명체는 정상 생장조건이 아닌 상태에 놓이게 되었을 때, Heat Shock Proteins (HSPs)이라 불리는 열충격 단백질을 생산하여 스트레스 상황에 대처한다. HSPs는 HSP100, HSP90, HSP70, ...
식물을 포함한 모든 생명체는 정상 생장조건이 아닌 상태에 놓이게 되었을 때, Heat Shock Proteins (HSPs)이라 불리는 열충격 단백질을 생산하여 스트레스 상황에 대처한다. HSPs는 HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 그리고 12-42 kDa의 분자량을 가지는 small HSPs (sHSPs)로 분자량에 따라 5개의 그룹으로 나눠진다. 몇몇 연구에서는 sHSPs의 molecular chaperone 기능에 N-terminal이 중요한 역할을 한다고 말하고 있다. 또한 ATP에 의해 chaperone 기능이 저해된다고 알려진 sHSPs와는 달리 HSP70의 경우 ATP가 chaperone 기능의 향상에 도움을 준다는 몇 몇 연구가 보고되었다.
당근의 sHSPs인 DcHsp17.7은 고온, 저온, 염분 등의 환경 스트레스에서 발현되며, molecular chaperone 기능을 수행한다는 것이 선행연구를 통해 밝혀졌다. 본 연구에서는 환경 스트레스 하에서 DcHsp17.7의 도메인에 따른 작용기작을 연구하였으며, 당근의 다른 열 충격 단백질인 DcHsp70의 작용기작을 조사하였다. 또한 DcHsp17.7을 이용하여 산업적으로 유용한 yeast 균주를 개발하는 연구를 진행하였다.
먼저, DcHsp70의 온도 스트레스 하에서 작용기작과 DcHsp70의 기능에 ATP의 영향을 알아보기 위하여 DcHsp70의 유전자를 E. coli에 도입한 후 IPTG 처리로 발현을 유도 하였다. 온도 스트레스 하에서 DcHsp70의 내성 향상 기능을 확인하기 위하여, DcHsp70의 발현이 유도된 세포에 고온 (50 ℃) 그리고 저온 (2 ℃) 스트레스 처리를 하여 생존율을 측정하였다. 고온 스트레스에서는 DcHsp70을 발현하는 transgenic cell이 vector control cell보다 30 % 가량의 더 높은 생존율을 보였다. 저온 스트레스에서도 마찬가지로 transgenic cell이 27% 정도 더 높은 생존율을 보였다. 또한 온도 스트레스 하에서 DcHsp70의 molecular chaperone 기능을 확인하고 chaperone 기능에 ATP의 영향을 확인하기 위해, transgenic cell과 control cell의 단백질을 고온 (50 ℃)과 저온 (0 ℃) 스트레스 처리와 함께 3.5 mM의 ATP를 처리해주어 soluble protein의 양을 측정하였다. 고온 스트레스에서는 transgenic cell의 soluble protein 양은 75% 까지 유지된 반면, control cell의 soluble protein은 46%까지 떨어져 약 30%의 큰 차이를 보였으며, ATP를 유무에 따른 soluble protein의 양은 transgenic cell의 경우 ATP를 처리하였을 때 10%정도 더 높은 soluble protein 레벨을 보여주었다. 저온 스트레스에서도 마찬가지로 vector control cell에 비해 transgenic cell의 단백질이 solubility가 높았으며 ATP를 함께 처리하였을 때 더 높은 solubility를 보여주었다. 스트레스 처리와 ATP 처리 시 DcHsp70의 stability를 immunoblot으로 확인한 결과, 스트레스 처리 시 DcHsp70의 양이 약간 감소하는 경향을 보이지만 ATP 처리 유무에 따른 stability의 차이는 보이지 않았다. 이러한 결과들은 DcHsp70이 세포의 스트레스 내성 기능을 향상시키고 단백질 변성을 막는 molecular chaperone 기능의 수행에 ATP 비의존적이라는 것을 시사한다.
다음으로, DcHsp17.7의 도메인 기능 연구를 위해 DcHsp17.7의 각 도메인별 variants를 E. coli에 도입하여 IPTG 처리로 발현을 유도한 후 immunoblot 기법으로 발현을 확인하였다. DcHsp17.7 domain variants의 스트레스 내성 향상 기능을 확인하기 위해 발현을 유도한 뒤 세포에 고온 (50 ℃), 저온 (2 ℃), 염분 (300 mM NaCl), 수분 부족 (20% PEG) 그리고 나노입자 (MWCNT와 AgNPs) 스트레스 처리를 한 후 생존율을 측정하였다. 저온을 제외한 모든 스트레스에서 N-terminal > full-length > C-terminal > Vector control의 순으로 높은 생존율을 보였으며, 고온에서는 N-terminal과 VC의 생존율 차이가 40%로 가장 큰 차이를 보였다. 다른 스트레스에서도 N-terminal과 VC은 20% 이상의 생존율 차이를 보이는 것을 확인했다. DcHsp17.7 variants의 molecular chaperone 기능을 확인하기 위해 위와 똑같은 조건의 고온, 저온, 염분, 수분 부족 그리고 나노입자 스트레스 하에서 transgenic cell과 control cell의 soluble protein 양을 측정하였다. 생존율과 마찬가지로 저온을 제외한 고온, 염분, 수분부족 스트레스에서 N-terminal > full-length > C-terminal > Vector control의 순으로 높은 레벨의 soluble protein 양을 유지하였다. 고온 스트레스에서 N-terminal이 포함된 soluble protein 양은 65% 정도로 유지된 반면, vector control의 soluble protein 양은 40% 정도까지 떨어져 25% 정도의 큰 차이를 나타냈다. 나노입자 스트레스의 경우 vector control의 단백질 양이 90 %이상 soluble 하게 유지되었고, 따라서 나노입자의 세포 독성은 단백질의 변성에 의해 일어나는 것이 아니라는 것을 시사한다. 이러한 결과들을 종합해보면, DcHsp17.7 domain의 기능을 스트레스에 따라 다르며, DcHsp17.7의 N-terminal이 세포의 스트레스 내성 향상과 molecular chaperone 기능에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
앞선 연구에 따라 세포의 스트레스 내성을 향상시키고 molecular chaperone 기능을 수행한다고 확인된 DcHsp17.7을 이용하여 스트레스에 내성을 가지는 yeast 균주를 개발하고자, 재조합 단백질에 많이 사용되는 진핵생물인 S. cerevisiae의 genome에 DcHsp17.7을 도입하였다. 재조합 단백질의 대량 생산 공정 중 발생할 수 있는 환경 스트레스에 대한 transgenic S. cerevisiae의 스트레스 내성 향상을 확인하기 위해 고온 (37 ℃, 40 ℃)과 저온 (25 ℃), 낮은 pH (pH4)와 높은 삼투압 (0.8M sorbitol)에서 세포의 성장률을 측
식물을 포함한 모든 생명체는 정상 생장조건이 아닌 상태에 놓이게 되었을 때, Heat Shock Proteins (HSPs)이라 불리는 열충격 단백질을 생산하여 스트레스 상황에 대처한다. HSPs는 HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 그리고 12-42 kDa의 분자량을 가지는 small HSPs (sHSPs)로 분자량에 따라 5개의 그룹으로 나눠진다. 몇몇 연구에서는 sHSPs의 molecular chaperone 기능에 N-terminal이 중요한 역할을 한다고 말하고 있다. 또한 ATP에 의해 chaperone 기능이 저해된다고 알려진 sHSPs와는 달리 HSP70의 경우 ATP가 chaperone 기능의 향상에 도움을 준다는 몇 몇 연구가 보고되었다.
당근의 sHSPs인 DcHsp17.7은 고온, 저온, 염분 등의 환경 스트레스에서 발현되며, molecular chaperone 기능을 수행한다는 것이 선행연구를 통해 밝혀졌다. 본 연구에서는 환경 스트레스 하에서 DcHsp17.7의 도메인에 따른 작용기작을 연구하였으며, 당근의 다른 열 충격 단백질인 DcHsp70의 작용기작을 조사하였다. 또한 DcHsp17.7을 이용하여 산업적으로 유용한 yeast 균주를 개발하는 연구를 진행하였다.
먼저, DcHsp70의 온도 스트레스 하에서 작용기작과 DcHsp70의 기능에 ATP의 영향을 알아보기 위하여 DcHsp70의 유전자를 E. coli에 도입한 후 IPTG 처리로 발현을 유도 하였다. 온도 스트레스 하에서 DcHsp70의 내성 향상 기능을 확인하기 위하여, DcHsp70의 발현이 유도된 세포에 고온 (50 ℃) 그리고 저온 (2 ℃) 스트레스 처리를 하여 생존율을 측정하였다. 고온 스트레스에서는 DcHsp70을 발현하는 transgenic cell이 vector control cell보다 30 % 가량의 더 높은 생존율을 보였다. 저온 스트레스에서도 마찬가지로 transgenic cell이 27% 정도 더 높은 생존율을 보였다. 또한 온도 스트레스 하에서 DcHsp70의 molecular chaperone 기능을 확인하고 chaperone 기능에 ATP의 영향을 확인하기 위해, transgenic cell과 control cell의 단백질을 고온 (50 ℃)과 저온 (0 ℃) 스트레스 처리와 함께 3.5 mM의 ATP를 처리해주어 soluble protein의 양을 측정하였다. 고온 스트레스에서는 transgenic cell의 soluble protein 양은 75% 까지 유지된 반면, control cell의 soluble protein은 46%까지 떨어져 약 30%의 큰 차이를 보였으며, ATP를 유무에 따른 soluble protein의 양은 transgenic cell의 경우 ATP를 처리하였을 때 10%정도 더 높은 soluble protein 레벨을 보여주었다. 저온 스트레스에서도 마찬가지로 vector control cell에 비해 transgenic cell의 단백질이 solubility가 높았으며 ATP를 함께 처리하였을 때 더 높은 solubility를 보여주었다. 스트레스 처리와 ATP 처리 시 DcHsp70의 stability를 immunoblot으로 확인한 결과, 스트레스 처리 시 DcHsp70의 양이 약간 감소하는 경향을 보이지만 ATP 처리 유무에 따른 stability의 차이는 보이지 않았다. 이러한 결과들은 DcHsp70이 세포의 스트레스 내성 기능을 향상시키고 단백질 변성을 막는 molecular chaperone 기능의 수행에 ATP 비의존적이라는 것을 시사한다.
다음으로, DcHsp17.7의 도메인 기능 연구를 위해 DcHsp17.7의 각 도메인별 variants를 E. coli에 도입하여 IPTG 처리로 발현을 유도한 후 immunoblot 기법으로 발현을 확인하였다. DcHsp17.7 domain variants의 스트레스 내성 향상 기능을 확인하기 위해 발현을 유도한 뒤 세포에 고온 (50 ℃), 저온 (2 ℃), 염분 (300 mM NaCl), 수분 부족 (20% PEG) 그리고 나노입자 (MWCNT와 AgNPs) 스트레스 처리를 한 후 생존율을 측정하였다. 저온을 제외한 모든 스트레스에서 N-terminal > full-length > C-terminal > Vector control의 순으로 높은 생존율을 보였으며, 고온에서는 N-terminal과 VC의 생존율 차이가 40%로 가장 큰 차이를 보였다. 다른 스트레스에서도 N-terminal과 VC은 20% 이상의 생존율 차이를 보이는 것을 확인했다. DcHsp17.7 variants의 molecular chaperone 기능을 확인하기 위해 위와 똑같은 조건의 고온, 저온, 염분, 수분 부족 그리고 나노입자 스트레스 하에서 transgenic cell과 control cell의 soluble protein 양을 측정하였다. 생존율과 마찬가지로 저온을 제외한 고온, 염분, 수분부족 스트레스에서 N-terminal > full-length > C-terminal > Vector control의 순으로 높은 레벨의 soluble protein 양을 유지하였다. 고온 스트레스에서 N-terminal이 포함된 soluble protein 양은 65% 정도로 유지된 반면, vector control의 soluble protein 양은 40% 정도까지 떨어져 25% 정도의 큰 차이를 나타냈다. 나노입자 스트레스의 경우 vector control의 단백질 양이 90 %이상 soluble 하게 유지되었고, 따라서 나노입자의 세포 독성은 단백질의 변성에 의해 일어나는 것이 아니라는 것을 시사한다. 이러한 결과들을 종합해보면, DcHsp17.7 domain의 기능을 스트레스에 따라 다르며, DcHsp17.7의 N-terminal이 세포의 스트레스 내성 향상과 molecular chaperone 기능에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
앞선 연구에 따라 세포의 스트레스 내성을 향상시키고 molecular chaperone 기능을 수행한다고 확인된 DcHsp17.7을 이용하여 스트레스에 내성을 가지는 yeast 균주를 개발하고자, 재조합 단백질에 많이 사용되는 진핵생물인 S. cerevisiae의 genome에 DcHsp17.7을 도입하였다. 재조합 단백질의 대량 생산 공정 중 발생할 수 있는 환경 스트레스에 대한 transgenic S. cerevisiae의 스트레스 내성 향상을 확인하기 위해 고온 (37 ℃, 40 ℃)과 저온 (25 ℃), 낮은 pH (pH4)와 높은 삼투압 (0.8M sorbitol)에서 세포의 성장률을 측
Functional Mechanism of Plant Heat Shock Protein and Development of Stress Tolerant Yeast Strain
DcHsp17.7, sHSPs of carrot (Daucus carota L.), was expressed under environmental stress such as high temperature, cold and salinity, etc. In this research, function of DcHsp17.7 domain was examined and ...
Functional Mechanism of Plant Heat Shock Protein and Development of Stress Tolerant Yeast Strain
DcHsp17.7, sHSPs of carrot (Daucus carota L.), was expressed under environmental stress such as high temperature, cold and salinity, etc. In this research, function of DcHsp17.7 domain was examined and function of DcHsp70, another heat shock protein of carrot, was examined under environmental stress. The research that develops industrially useful yeast strain using DcHsp17.7 was proceed.
First, to examine the function of DcHsp70, DcHsp70 was cloned and transformed to E. coli. Heterologous expression of DcHsp70 was confirmed by immunoblot analysis. Transgenic cell expressing DcHsp70 showed higher cell viability and solubility of protein under the high and low temperature stress than vector control. DcHsp70 showed higher solubility and stability of protein when presence ATP than absence ATP under stresses. Thus, these results suggest that DcHsp70 performs the role of molecular chaperone under high or low temperature stress and molecular chaperone function was improved in the presence of ATP.
Second, to examine the domain function of DcHsp17.7, each domain variants of DcHsp17.7 were cloned and transformed to E. coli. Heterologous expression of DcHsp17.7 domain variants was confirmed by immunoblot analysis. Transgenic cell expressing each domain of DcHsp17.7 showed more improvement in stress tolerance of cell and solubility of protein than vector control under abiotic stresses (high temperature, low temperature, salinity, drought and nanomaterials). In all the stress conditions we applied, transgenic cell expressing N-terminal of DcHsp17.7 was shown the highest cell viability and solubility of proteins. Thus, these results suggest that domain function of DcHsp17.7 performed differently depending on the type of stresses and N-terminal of DcHsp17.7 is the domain that performed important role in the function of molecular chaperone.
Finally, to develop the yeast strain with improved stress tolerance through homologous recombinant, DcHsp17.7 was inserted into the genome of yeast. Heterologous expression of DcHsp17.7 was confirmed by immunoblot analysis. Transgenic cells expressing DcHsp17.7 showed higher cell viability and solubility of protein under stress conditions (high temperature, low temperature, low pH, and osmotic) than controls. Thus, these results suggest that yeast strain with improved stress tolerance using DcHsp17.7 was developed successfully.
This study will provide the information useful for the development of crop with stress tolerance under various environments and develop yeast strains heterologously expressing DcHsp17.7 throw homologous recombinant which will be useful for industrial application.
Functional Mechanism of Plant Heat Shock Protein and Development of Stress Tolerant Yeast Strain
DcHsp17.7, sHSPs of carrot (Daucus carota L.), was expressed under environmental stress such as high temperature, cold and salinity, etc. In this research, function of DcHsp17.7 domain was examined and function of DcHsp70, another heat shock protein of carrot, was examined under environmental stress. The research that develops industrially useful yeast strain using DcHsp17.7 was proceed.
First, to examine the function of DcHsp70, DcHsp70 was cloned and transformed to E. coli. Heterologous expression of DcHsp70 was confirmed by immunoblot analysis. Transgenic cell expressing DcHsp70 showed higher cell viability and solubility of protein under the high and low temperature stress than vector control. DcHsp70 showed higher solubility and stability of protein when presence ATP than absence ATP under stresses. Thus, these results suggest that DcHsp70 performs the role of molecular chaperone under high or low temperature stress and molecular chaperone function was improved in the presence of ATP.
Second, to examine the domain function of DcHsp17.7, each domain variants of DcHsp17.7 were cloned and transformed to E. coli. Heterologous expression of DcHsp17.7 domain variants was confirmed by immunoblot analysis. Transgenic cell expressing each domain of DcHsp17.7 showed more improvement in stress tolerance of cell and solubility of protein than vector control under abiotic stresses (high temperature, low temperature, salinity, drought and nanomaterials). In all the stress conditions we applied, transgenic cell expressing N-terminal of DcHsp17.7 was shown the highest cell viability and solubility of proteins. Thus, these results suggest that domain function of DcHsp17.7 performed differently depending on the type of stresses and N-terminal of DcHsp17.7 is the domain that performed important role in the function of molecular chaperone.
Finally, to develop the yeast strain with improved stress tolerance through homologous recombinant, DcHsp17.7 was inserted into the genome of yeast. Heterologous expression of DcHsp17.7 was confirmed by immunoblot analysis. Transgenic cells expressing DcHsp17.7 showed higher cell viability and solubility of protein under stress conditions (high temperature, low temperature, low pH, and osmotic) than controls. Thus, these results suggest that yeast strain with improved stress tolerance using DcHsp17.7 was developed successfully.
This study will provide the information useful for the development of crop with stress tolerance under various environments and develop yeast strains heterologously expressing DcHsp17.7 throw homologous recombinant which will be useful for industrial application.
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