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문제 정의
- B. subtilis AF4가 가지는 생리활성을 보다 구체적으로 조사하기 위하여 식물생육 촉진 활성과 길항 가능한 곰팡이의 종류를 조사하였다. 실험 균주의 배양상등액은 Nessler 시약과 Salkowsky 시약에 의하여 각각 노란색과 분홍색으로 변화됨에 따라 암모니아와 식물성장호르몬인 indole-3-acetic acid를 생성할 수 있음을 알 수 있었다 (Fig.
- 또한 내 생포자를 형성하는 Bacillus 속 균주는 열악한 환경에서도 안정성을 유지할 수 있기 때문에 생물방제균으로서 큰장점을 가진다[15, 20]. 따라서 본 연구에서는 다양한 농작물의근권 토양으로부터 Bacillus 속 균주를 분리하여 식물병원성곰팡이에 대한항진균 활성 및 식물생육 촉진 활성을 조사함으로써 생물학적 방제에 이용될 수 있는 새로운 토착 미생물자원을 확보하고자 하였다.
제안 방법
- coli 16S rRNA 유전자의 보존서열을 기초로하여 합성된 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') pri- mer와 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') pri- mer이었다[14]. 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정한 후, GenBank에 등록된 다른 유사균주들과 비교하였다. 또한 염기서열을 Clustal X (version 1.
- B. cinerea에 대한 B. subtilis AF4의 항진균 효과는 위상차현미경과 주사 전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 즉 PDA 평판배지에 B.
- 항진균물질 생산에 영향을 미치는 배지 성분을 조사하기 위하여 탄소원(fructose, glucose, glyc- erol, lactose, maltose, sorbitol, sucrose), 질소원(bactopep- tone, beef extract, casein, corn steep liquor, polypeptone, tryptone, yeast extract, (NH4)2SO4, NH4NO3, KNO3), 초기 pH (pH 4-11) 및 배양 온도(10℃-45℃)에 따른 항진균 활성을 조사하였다. Nutrient broth에서 30℃, 200 rpm으로 18시 간 동안 배양한 전 배양액을 2% 접종하였으며, 다른 언급이 없는 한 30℃, 200 rpm에서 48시간 동안 배양한 후, 항진균 활성을 조사하였다.
- cinerea를 PDA 평판 배지에 접종하여 28℃에서 6일간 배양하였다. PDA 배지 표면에 1% Tween 80용액을 적하하여포자를 회수한 후, 멸균된 거즈를 이용하여 균사체를 제거하여 포자 현탁액을 조제하였다. 항진균 활성을 측정하기 위하여포자의 농도를 1-4×105 spore/ml가 되도록 조정하였다.
- 경남 밀양 일원의 경작지 토양, 각종 농작물의 근권 토양 등을 채집한 후, Bacillus 속 균주를 분리하기 위하여 80℃, 30분 동안 가열처리하였다. 이렇게 처리된 각 시료 1 g을 멸균된 0.
- 또한 다양한 식물병원성 곰팡이(Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phythium ultimum, Sclerotinia scle- rotiorum, Colletotrichum gloeosporioides)를 대상으로 PDA 평판배지에 대치배양을 실시한 후, 생육 저지대 생성 유무를 조사하였다.
- 제균된 배양상등액을 열처리(40-100℃ × 1시간, 121℃ × 15분) 한 후, 실온으로 냉각시켜 항진균 활성을 조사하였다. 또한 배양 상등액을 각종 유기용매(acetic acid, acetone, acetoni- trilie, dichloromethane, propanol, methanol, ethanol, chloro- form, hexane)와 1:1 (v/v)로 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치 및 100℃에서 60분간 열처리하여 유기용매를 휘발시킨 후, 항진균 활성을 조사하였다. 배양상등액에 proteinase K 및 pepsin을 0.
- 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정한 후, GenBank에 등록된 다른 유사균주들과 비교하였다. 또한 염기서열을 Clustal X (version 1.81)를 이용하여 정렬한 후, MEGA4 프로그램을 이용하여 각균주들의 계통 분류학적 위치를 결정하였다.
- 조사하였다. 또한, 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석함으로써 계통학적동정을 실시하였다. 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 사용된 primer는 E.
- 또한 배양 상등액을 각종 유기용매(acetic acid, acetone, acetoni- trilie, dichloromethane, propanol, methanol, ethanol, chloro- form, hexane)와 1:1 (v/v)로 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치 및 100℃에서 60분간 열처리하여 유기용매를 휘발시킨 후, 항진균 활성을 조사하였다. 배양상등액에 proteinase K 및 pepsin을 0.5 mg/ml의 농도로 처리하여 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후, 항진균 활성을 조사하였다.
- 방치하였다. 시료들을 pH 7로 다시 조정한 후, 항진균 활성을 조사하였다. 제균된 배양상등액을 열처리(40-100℃ × 1시간, 121℃ × 15분) 한 후, 실온으로 냉각시켜 항진균 활성을 조사하였다.
- 시료들을 pH 7로 다시 조정한 후, 항진균 활성을 조사하였다. 제균된 배양상등액을 열처리(40-100℃ × 1시간, 121℃ × 15분) 한 후, 실온으로 냉각시켜 항진균 활성을 조사하였다. 또한 배양 상등액을 각종 유기용매(acetic acid, acetone, acetoni- trilie, dichloromethane, propanol, methanol, ethanol, chloro- form, hexane)와 1:1 (v/v)로 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치 및 100℃에서 60분간 열처리하여 유기용매를 휘발시킨 후, 항진균 활성을 조사하였다.
- subtilis AF4의 항진균 효과는 위상차현미경과 주사 전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 즉 PDA 평판배지에 B. subtilis AF4와 B. cinerea를 대치배양한 후, 균사생육이 저해된 부분과 저해되지 않은 부분을 현미경으로 관찰하여 균사의 형태 변화를 조사하였다.
- Corn steep liq- uor, (NH4)2SO4를 제외한 모든 유, 무기질 소원에서 항진균 물질이 생성되었다. 특히, 기본 배지의 질소 원인 0.1% (NH4)2SO4 및 0.1% yeast extract 혼합물(122±2 AU/ml)과 casein(126±2 AU/ml)을 첨가했을 때, 높은 항진균물질의 생성이 이루어졌다. 따라서 casein의 농도를 0.
- 45 μm 세균여과막을 이용하여제균하였다. 피검균주의 포자현탁액이 도 말된 PDA 평판배지에 cork borer를 이용하여 직경 0.8 cm의 구멍을 뚫은 후, 제균된 배양상등액 200 μl를 분주하였다. 30℃에서 48시간동안배양한 후, 생육 저지대의 직경을 측정하였다.
- PDA 배지 표면에 1% Tween 80용액을 적하하여포자를 회수한 후, 멸균된 거즈를 이용하여 균사체를 제거하여 포자 현탁액을 조제하였다. 항진균 활성을 측정하기 위하여포자의 농도를 1-4×105 spore/ml가 되도록 조정하였다.
- 1% (pH 7)이었다. 항진균물질 생산에 영향을 미치는 배지 성분을 조사하기 위하여 탄소원(fructose, glucose, glyc- erol, lactose, maltose, sorbitol, sucrose), 질소원(bactopep- tone, beef extract, casein, corn steep liquor, polypeptone, tryptone, yeast extract, (NH4)2SO4, NH4NO3, KNO3), 초기 pH (pH 4-11) 및 배양 온도(10℃-45℃)에 따른 항진균 활성을 조사하였다. Nutrient broth에서 30℃, 200 rpm으로 18시 간 동안 배양한 전 배양액을 2% 접종하였으며, 다른 언급이 없는 한 30℃, 200 rpm에서 48시간 동안 배양한 후, 항진균 활성을 조사하였다.
대상 데이터
- cinerea의생육을 저해하는 35균주를 분리하였다. 그 중 고추의 근권토양으로부터 분리된 AF4 균주가 B. cinerea에 대해 가장 큰생육 저지대를 나타내어 최종 실험 균주로 선정하였다. AF4 균주는 그 람 양성세균으로 내생포자를 형성하였으며, 운동성이 있는 간균이었다.
- 본 실험에 사용된 기본 배지의 조성은 sucrose 2%, (NH4)2SO4 0.1%, KH2PO4 0.08%, Na2HPO4 0.1%, MgSO4 0.01%, MnCl2 0.0004%, CaCl2 0.0005%, FeSO4 0.0025%, yeast extract 0.1% (pH 7)이었다. 항진균물질 생산에 영향을 미치는 배지 성분을 조사하기 위하여 탄소원(fructose, glucose, glyc- erol, lactose, maltose, sorbitol, sucrose), 질소원(bactopep- tone, beef extract, casein, corn steep liquor, polypeptone, tryptone, yeast extract, (NH4)2SO4, NH4NO3, KNO3), 초기 pH (pH 4-11) 및 배양 온도(10℃-45℃)에 따른 항진균 활성을 조사하였다.
- 각 희석액을 nutrient agar 평판 배지에 접종하여 30℃에서 배양함으로써 각균주를 순수 분리하였다. 순수분리된 균주들 중 잿빛 곰팡이병균인 Botyris cinerea에 대한 항진균 활성을 보유한 균주를 선정하기 위하여 potato dextrose agar (PDA) 평판 배지에 대치배양을 실시한 후, B. cinerea 의 생육을 저해하는 균주를 실험 균주로 선정하였다.
이론/모형
- 실험 균주를 동정하기 위하여 Manual of methods for gen- eral bacteriology [10]에준하여 표현형적 특성을 조사하였다. 또한, 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석함으로써 계통학적동정을 실시하였다.
- 실험 균주의 siderophore 생성능은 Chrome azurol S assay [21], indole-3-acetic acid 생 성능은 Tang과 Bonner의 방법 [24], ammonificatione Dey 등[7]의 방법, 식물병원성 곰팡이 세포성분 분해 효소(chitinase, cellulase, pectinase, protease, amylase, lipase)의 활성은 Gerhardt 등[10] 의 방법에 의하여 정성 분석하였다. 또한 다양한 식물병원성 곰팡이(Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phythium ultimum, Sclerotinia scle- rotiorum, Colletotrichum gloeosporioides)를 대상으로 PDA 평판배지에 대치배양을 실시한 후, 생육 저지대 생성 유무를 조사하였다.
성능/효과
- 실험균주를 정확하게 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 NCBI GenBank에 등록된 각 표준균주와 비교한결과, AF4 균주는 Bacillus subtilis와 99%의 상동성을 가지고있었다. 16S rRNA 유전자의 구조에 근거하여 기존 Bacillus 속 균주와의 분자 계통학적 유연관계를 파악하기 위하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과, AF4 균주는 B. subtilisT 을 포함하는 계통학적 그룹에 포함됨을 알 수 있었다 (Fig. 1).
- Table 3에서 보는 바와 같다. 40℃에서 100℃의 범위에서 100% 활성을 나타내었으며, 121℃에서 15분의 열처리에도 불구하고 81%의 높은 활성을 나타내었다. 따라서 본 실험 균주가 생성하는 항진균물질은 열에 안정한 물질로 추정되었다.
- 2에서 보는 바와 같다. pH 4-6 및 pH 11에서 균체는 생육할 수 없었고, 결과적으로 항진균물질의 생성도 이루어지지 않았다. 반면, pH 7-10에서는 균체 생육과 항진균 물질의 생성이 모두 이루어졌으며, 그 중 pH 7에서 항진균물질이 가장 많이 생성되었다.
- 1% yeast extract 혼합물(122±2 AU/ml)과 casein(126±2 AU/ml)을 첨가했을 때, 높은 항진균물질의 생성이 이루어졌다. 따라서 casein의 농도를 0.1%에서 0.5%까지 각각 달리 조정하여 배양한 결과, 0.3%에서 가장 높은 항진균물질 생성이이루어졌다(131±4 AU/ml). 탄소원과 마찬가지로 질소원 역시 세균에 따라 항진균 물질 생성에 요구하는 종류가 다르다.
- 40℃에서 100℃의 범위에서 100% 활성을 나타내었으며, 121℃에서 15분의 열처리에도 불구하고 81%의 높은 활성을 나타내었다. 따라서 본 실험 균주가 생성하는 항진균물질은 열에 안정한 물질로 추정되었다. 실험 균주의 배양상등액은 pH 5, 6에서 100%, pH 8-11에서 90-93%의 활성을 나타내었으나 pH 4 이하의 산성 영역에서 활성은 크게 감소하였다.
- 많은 농작물 재배시의 토양온도는 30 ℃ 내외인 것으로 알려져 있다 [17]. 따라서 본 실험 균주는 실제 농작물 재배지에서 온도에 따른 영향을 받지 않을 것으로 판단된다.
- 실험 균주의 배양상등액은 pH 5, 6에서 100%, pH 8-11에서 90-93%의 활성을 나타내었으나 pH 4 이하의 산성 영역에서 활성은 크게 감소하였다. 또한 배양상등액은 acetic acid를 제외한 모든 실험용매에 대해 높은 활성을 나타내었으며, proteinase K 및 pepsin 처리시에도 활성이 100% 유지됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 본 실험 균주가 생성하는 항진균물질은 bacteriocin이나 세포 외 효소가 아니라 세포외 로 분비되는 비 단백질성 물질임을 시사한다.
- 암모니아는 휘발성 항진균 물질로 작용하며, indole-3-acetic acid는 열매의 형성과 뿌리의 신장에 관여하는 것으로 알려져 있다 [7, 9]. 또한 본 실험 균주는 식물세포 성분 분해효소인 cellulase, protease, amylase, lipase를 생성할 수 있었으며, Alternaria panax, Cylinderocarpon destructans, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Phytophthora cactorum, Pythium ultimum 등의 다양한 식물병원성 곰팡이의 생육을 저해할 수 있었다. 반면, 실험 균주는 siderophore, chitinase를 생성할 수 없었고, 불용성 인산 가용화능도 없었다.
- pH 4-6 및 pH 11에서 균체는 생육할 수 없었고, 결과적으로 항진균물질의 생성도 이루어지지 않았다. 반면, pH 7-10에서는 균체 생육과 항진균 물질의 생성이 모두 이루어졌으며, 그 중 pH 7에서 항진균물질이 가장 많이 생성되었다.
- 2%씩 첨가하여 배양한 결과는 Table 1에서 보는 바와 같다. 실험 균주에 의한 항진균 물질생산에는 질소원이 필수적임을 알 수 있었다. Corn steep liq- uor, (NH4)2SO4를 제외한 모든 유, 무기질 소원에서 항진균 물질이 생성되었다.
- subtilis AF4가 가지는 생리활성을 보다 구체적으로 조사하기 위하여 식물생육 촉진 활성과 길항 가능한 곰팡이의 종류를 조사하였다. 실험 균주의 배양상등액은 Nessler 시약과 Salkowsky 시약에 의하여 각각 노란색과 분홍색으로 변화됨에 따라 암모니아와 식물성장호르몬인 indole-3-acetic acid를 생성할 수 있음을 알 수 있었다 (Fig. 5).암모니아는 휘발성 항진균 물질로 작용하며, indole-3-acetic acid는 열매의 형성과 뿌리의 신장에 관여하는 것으로 알려져 있다 [7, 9].
- 따라서 본 실험 균주가 생성하는 항진균물질은 열에 안정한 물질로 추정되었다. 실험 균주의 배양상등액은 pH 5, 6에서 100%, pH 8-11에서 90-93%의 활성을 나타내었으나 pH 4 이하의 산성 영역에서 활성은 크게 감소하였다. 또한 배양상등액은 acetic acid를 제외한 모든 실험용매에 대해 높은 활성을 나타내었으며, proteinase K 및 pepsin 처리시에도 활성이 100% 유지됨을 알 수 있었다.
- 또한 glucose로부터 산을 생성할 수 있었고, nitrate 를 환원시킬 수 있었으며, indolee 생성하지 못했다. 실험균주를 정확하게 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 NCBI GenBank에 등록된 각 표준균주와 비교한결과, AF4 균주는 Bacillus subtilis와 99%의 상동성을 가지고있었다. 16S rRNA 유전자의 구조에 근거하여 기존 Bacillus 속 균주와의 분자 계통학적 유연관계를 파악하기 위하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과, AF4 균주는 B.
- 실험 균주의 항진균 물질 생산에 대한 탄소원의 영향을 조사하기 위하여 기본 배지에 각탄소원을 2%씩 첨가하여 배양한 결과는 Table 1에서 보는 바와 같다. 실험에 사용된 모든 탄소원에서 항진균 물질의 생성이 이루어졌으며, 특히 glycerol을 첨가한 경우에 가장 높은항진균 활성(112±2 AU/ml)을 나타내었다. 탄소원을 첨가하지 않은 경우에도 항진균물질이 생성(80±2 AU/ml)되었는데, 이것은 기본배지 성분 중 질소원의 하나인 yeast extract에 기인하는 것으로 판단된다.
- 요약하면, 고추의 근권토양에서 분리된 B. subtilis AF4는 넓은 pH와 온도 영역에서 B. cinerea에 대한 항진균 활성을 가지고 있었으며, 실험 균주가 생성한 항진균물질은 다양한 환경 스트레스에 대해 높은 안정성을 가지고 있었다. 또한 다양한 식물생육 촉진 활성을 보유함과 동시에 항진균 스펙트럼 역시 넓었다.
- 또한 배양상등액은 acetic acid를 제외한 모든 실험용매에 대해 높은 활성을 나타내었으며, proteinase K 및 pepsin 처리시에도 활성이 100% 유지됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 본 실험 균주가 생성하는 항진균물질은 bacteriocin이나 세포 외 효소가 아니라 세포외 로 분비되는 비 단백질성 물질임을 시사한다. 향후, 생성된 물질의 구조를 파악해 보아야 정확하게 알 수 있겠지만 현 실험 결과만으로 판단 내리면 iturin 계열의 항진균물질인 것으로 판단된다.
- 3에서 보는 바와 같다. 최적 배지에서 실험 균주의 균체생육은 48시간까지 증가하였으며, 그 후 96시간까지 정지기를 유지하였다. 항진균 활성은 60시간에 가장 높았으며, 그 후 일정하게 유지되었다.
- 탄소원을 첨가하지 않은 경우에도 항진균물질이 생성(80±2 AU/ml)되었는데, 이것은 기본배지 성분 중 질소원의 하나인 yeast extract에 기인하는 것으로 판단된다. 최적 탄소 원인 glycerol의 농도를 0.5%에서 4%까지 각각 달리 조정하여 배양한 결과, glycerol 의 농도 증가에 따라 항진균 물질의 생산은 증가하였으며, 2.5%에서 가장 높은 항진균물질 생성이 이루어졌다(124±3 AU/ml). 항진균 물질 생산에 최적인 탄소원은 세균에 따라다른 것으로 알려져 있다.
- 항진균 활성은 60시간에 가장 높았으며, 그 후 일정하게 유지되었다. 최적조건에서의항진균 활성은 60시간에 140±3 AU/ml을 나타내어 기본조건 (115±4 AU/ml)보다 활성이 증가했음을 알 수 있었다.
- 최적 배지에서 실험 균주의 균체생육은 48시간까지 증가하였으며, 그 후 96시간까지 정지기를 유지하였다. 항진균 활성은 60시간에 가장 높았으며, 그 후 일정하게 유지되었다. 최적조건에서의항진균 활성은 60시간에 140±3 AU/ml을 나타내어 기본조건 (115±4 AU/ml)보다 활성이 증가했음을 알 수 있었다.
후속연구
- 또한 다양한 식물생육 촉진 활성을 보유함과 동시에 항진균 스펙트럼 역시 넓었다. 앞으로 야외 실험을 통하여 항진균 효과를 검증해야 하겠지만 본 실험 균주는 환경친화적 미생물농약으로서의 잠재성을 가진 균주로 판단된다.
- 이러한 결과는 본 실험 균주가 생성하는 항진균물질은 bacteriocin이나 세포 외 효소가 아니라 세포외 로 분비되는 비 단백질성 물질임을 시사한다. 향후, 생성된 물질의 구조를 파악해 보아야 정확하게 알 수 있겠지만 현 실험 결과만으로 판단 내리면 iturin 계열의 항진균물질인 것으로 판단된다. [5].
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