[학위논문]역전사 등온증폭법을 이용한 주요 콩 바이러스 3종의 현장진단법 개발 Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for field diagnosis of Soybean mosaic virus, Soybean yellow mottle mosaic virus, Soybean yellow common mosaic virus원문보기
콩[Glycine max (L.) Merr.]은 장미목(Rosales) 콩과(Leguminosae)에 속하는 한해살이 쌍떡잎식물로 한반도를 포함한 아시아 동북부 지역이 원산지로 알려져 있으며, 전 세계적으로 550속 13,000종, 우리나라에서는 36속 92종이 자생하고 있다. 콩은 단백질과 지방 공급원으로 예로부터 중요시 되는 작물로써, 현재는 공업용 소재로도 각광받고 있는 작물이다(Ann, 2012). 국내에 최근 콩 생산량은 연간 13만 9천 톤 정도이다. 국내 총 재배면적은 74,652 ha로 그 중 생산량은 경북이 26,000 톤으로 가장 많으며, 다음으로 충북(23,000 톤), 전남(16,000 톤) 순으로 재배되고 있다(통계청, 2014; 2015). 콩을 기주로 하는 바이러스는 약 110여 종으로 보고되어있고, 이 중 약 40종의 바이러스가 세계적으로 생산량의 감소와 품질저하를 초래하여 경제적으로 큰 피해를 주고 있다(Demski 등, 1983; Thottapilly와 Rossel, 1987; Sinclair and Backman, 1989; Kim 등, 1997;). 그중에 Soybean ...
콩[Glycine max (L.) Merr.]은 장미목(Rosales) 콩과(Leguminosae)에 속하는 한해살이 쌍떡잎식물로 한반도를 포함한 아시아 동북부 지역이 원산지로 알려져 있으며, 전 세계적으로 550속 13,000종, 우리나라에서는 36속 92종이 자생하고 있다. 콩은 단백질과 지방 공급원으로 예로부터 중요시 되는 작물로써, 현재는 공업용 소재로도 각광받고 있는 작물이다(Ann, 2012). 국내에 최근 콩 생산량은 연간 13만 9천 톤 정도이다. 국내 총 재배면적은 74,652 ha로 그 중 생산량은 경북이 26,000 톤으로 가장 많으며, 다음으로 충북(23,000 톤), 전남(16,000 톤) 순으로 재배되고 있다(통계청, 2014; 2015). 콩을 기주로 하는 바이러스는 약 110여 종으로 보고되어있고, 이 중 약 40종의 바이러스가 세계적으로 생산량의 감소와 품질저하를 초래하여 경제적으로 큰 피해를 주고 있다(Demski 등, 1983; Thottapilly와 Rossel, 1987; Sinclair and Backman, 1989; Kim 등, 1997;). 그중에 Soybean mosaic virus (SMV; Potyvirus), Soybean yellow mottle mosaic virus (SYMMV; Carmovirus), Soybean yellow common mosaic virus (SYCMV; Sobemovirus)는 국내 콩 포장에서 가장 빈번하게 발생하는 바이러스이다(Lee 등, 2012). SMV는 진딧물을 통해 충매전염 되며, 콩에서 최대 43%의 종자전염이 이루어지는 것으로 보고되어 있다. 이 바이러스는 콩 생산량과 직접적으로 관련 있는 꼬투리 수의 감소, 꼬투리 당 종자수의 감소, 종자의 크기 및 중량의 감소와 콩 껍질의 얼룩생성 등을 초래한다(Domier 등, 2007, 2011). SMV는 국내에 11개 계통들이 보고되어있으며, 저항성 유전자를 극복하는 계통들이 계속적으로 나타나고 있다(Seo 등, 2009). SYMMV는 최근에 우리나라에서 발견된 신종 바이러스이고(Kim, 2006), 최근 콩에서 발생하는 바이러스의 발생현황이 변하면서 SMV와 함께 콩에서 발생률이 가장 높은 바이러스이다(Lee, 2012). SYCMV는 발생은 최근에 우리나라에 보고되었지만 아직까지 매개곤충 및 전염방법에 대한 세부 연구는 이루어지지 않았다. 또한 이 바이러스는 대두와 야생콩(Glycine soja)에 한하여 모자이크증상을 일으키는 것으로 보고되어 있다(Nam 등, 2011). 최근 주로 사용되는 바이러스 진단방법은 Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) 방법과 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 방법이다. ELISA 방법은 많은 양의 시료를 쉽게 검사하는 장점을 가지지만 검출한계의 문제와 검사결과 판독의 오류 가능성이 존재한다(Lee 등, 2010). RT-PCR 진단방법은 진단 시료수가 많아질수록 진단비용과 소요시간, 기술 숙련도 및 별도의 장비들이 많이 필요하다는 단점이 있다(Li와 Mock, 2005). 최근에는 일반적 유전자 진단법의 단점을 극복하기 위하여 간단하고 빠르게 식물 바이러스를 진단하는 연구가 이루어져왔다. Notomi 등(2000)은 strand displacement activity가 높은 Bst polymerase를 이용하여 등온에서 특정 유전자를 loop 구조로 증폭시키는 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)법을 고안하였다. PCR의 경우 2개의 primer들을 사용하는 것과는 달리, LAMP방법은 6개 영역을 인식하는 4개의 primer들을 사용하게 된다. 증폭 효율이 높고, template를 1시간 내에 109―1010배까지 증폭시킬 수 있으며, 매우 높은 특이성을 나타내므로 목적 DNA 배열의 존재를 증폭산물의 유무로 판정할 수 있다. PCR방법과 유사하지만 기존의 중합효소 연쇄반응이 변성(denaturation), 접합(annealing), 신장(extention) 세 가지 단계를 거치면서 온도의 변화를 주어야 하지만 LAMP방법은 등온에서 접합 및 신장이 가능하게 한다(Blomstrom 등, 2008; Nagamine 등, 2002). RNA 바이러스를 RT-PCR을 이용하여 검출하기 위해서는 역전사과정이 수반되기 때문에 일반 DNA 바이러스를 검출하는 것보다 더 많은 시간이 소모된다. 하지만, RT-LAMP는 LAMP와 마찬가지로 등온에서 역전사과정과 LAMP반응을 동시에 수행함으로서 진단 시간을 현저히 줄일 수 있는 장점이 있어 이미 다른 분야에서는 RT-LAMP가 적용되고 있다(Fukuta 등, 2003; Parida 등, 2004). 또한 일정한 온도만 유지가 된다면 반응이 이루어지기 때문에 등온 유지가 가능한 항온수조나 발열블록 등 저가의 장비에서도 반응이 가능하여 고가의 유전자증폭기 장비가 필요하지 않다. 그리고 SYBR Green I 을 사용하여 전기영동 없이 육안확인이 가능하기 때문에 인체에 유해한 ethidium bromide (EtBr)을 사용 하지 않고, 현장 및 기타 어느 장소에서도 병원체에 대한 진단이 가능한 장점을 가지고 있다. 본 연구에서는 특이성, 정밀성, 간편성을 갖춘 분자기법 중 하나인 RT-LAMP방법을 이용하여 콩의 중요 바이러스인 SMV, SYMMV, SYCMV의 감염 유무를 신속하게 확인할 수 있는 진단법을 개발하였다.
콩[Glycine max (L.) Merr.]은 장미목(Rosales) 콩과(Leguminosae)에 속하는 한해살이 쌍떡잎식물로 한반도를 포함한 아시아 동북부 지역이 원산지로 알려져 있으며, 전 세계적으로 550속 13,000종, 우리나라에서는 36속 92종이 자생하고 있다. 콩은 단백질과 지방 공급원으로 예로부터 중요시 되는 작물로써, 현재는 공업용 소재로도 각광받고 있는 작물이다(Ann, 2012). 국내에 최근 콩 생산량은 연간 13만 9천 톤 정도이다. 국내 총 재배면적은 74,652 ha로 그 중 생산량은 경북이 26,000 톤으로 가장 많으며, 다음으로 충북(23,000 톤), 전남(16,000 톤) 순으로 재배되고 있다(통계청, 2014; 2015). 콩을 기주로 하는 바이러스는 약 110여 종으로 보고되어있고, 이 중 약 40종의 바이러스가 세계적으로 생산량의 감소와 품질저하를 초래하여 경제적으로 큰 피해를 주고 있다(Demski 등, 1983; Thottapilly와 Rossel, 1987; Sinclair and Backman, 1989; Kim 등, 1997;). 그중에 Soybean mosaic virus (SMV; Potyvirus), Soybean yellow mottle mosaic virus (SYMMV; Carmovirus), Soybean yellow common mosaic virus (SYCMV; Sobemovirus)는 국내 콩 포장에서 가장 빈번하게 발생하는 바이러스이다(Lee 등, 2012). SMV는 진딧물을 통해 충매전염 되며, 콩에서 최대 43%의 종자전염이 이루어지는 것으로 보고되어 있다. 이 바이러스는 콩 생산량과 직접적으로 관련 있는 꼬투리 수의 감소, 꼬투리 당 종자수의 감소, 종자의 크기 및 중량의 감소와 콩 껍질의 얼룩생성 등을 초래한다(Domier 등, 2007, 2011). SMV는 국내에 11개 계통들이 보고되어있으며, 저항성 유전자를 극복하는 계통들이 계속적으로 나타나고 있다(Seo 등, 2009). SYMMV는 최근에 우리나라에서 발견된 신종 바이러스이고(Kim, 2006), 최근 콩에서 발생하는 바이러스의 발생현황이 변하면서 SMV와 함께 콩에서 발생률이 가장 높은 바이러스이다(Lee, 2012). SYCMV는 발생은 최근에 우리나라에 보고되었지만 아직까지 매개곤충 및 전염방법에 대한 세부 연구는 이루어지지 않았다. 또한 이 바이러스는 대두와 야생콩(Glycine soja)에 한하여 모자이크증상을 일으키는 것으로 보고되어 있다(Nam 등, 2011). 최근 주로 사용되는 바이러스 진단방법은 Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) 방법과 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 방법이다. ELISA 방법은 많은 양의 시료를 쉽게 검사하는 장점을 가지지만 검출한계의 문제와 검사결과 판독의 오류 가능성이 존재한다(Lee 등, 2010). RT-PCR 진단방법은 진단 시료수가 많아질수록 진단비용과 소요시간, 기술 숙련도 및 별도의 장비들이 많이 필요하다는 단점이 있다(Li와 Mock, 2005). 최근에는 일반적 유전자 진단법의 단점을 극복하기 위하여 간단하고 빠르게 식물 바이러스를 진단하는 연구가 이루어져왔다. Notomi 등(2000)은 strand displacement activity가 높은 Bst polymerase를 이용하여 등온에서 특정 유전자를 loop 구조로 증폭시키는 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)법을 고안하였다. PCR의 경우 2개의 primer들을 사용하는 것과는 달리, LAMP방법은 6개 영역을 인식하는 4개의 primer들을 사용하게 된다. 증폭 효율이 높고, template를 1시간 내에 109―1010배까지 증폭시킬 수 있으며, 매우 높은 특이성을 나타내므로 목적 DNA 배열의 존재를 증폭산물의 유무로 판정할 수 있다. PCR방법과 유사하지만 기존의 중합효소 연쇄반응이 변성(denaturation), 접합(annealing), 신장(extention) 세 가지 단계를 거치면서 온도의 변화를 주어야 하지만 LAMP방법은 등온에서 접합 및 신장이 가능하게 한다(Blomstrom 등, 2008; Nagamine 등, 2002). RNA 바이러스를 RT-PCR을 이용하여 검출하기 위해서는 역전사과정이 수반되기 때문에 일반 DNA 바이러스를 검출하는 것보다 더 많은 시간이 소모된다. 하지만, RT-LAMP는 LAMP와 마찬가지로 등온에서 역전사과정과 LAMP반응을 동시에 수행함으로서 진단 시간을 현저히 줄일 수 있는 장점이 있어 이미 다른 분야에서는 RT-LAMP가 적용되고 있다(Fukuta 등, 2003; Parida 등, 2004). 또한 일정한 온도만 유지가 된다면 반응이 이루어지기 때문에 등온 유지가 가능한 항온수조나 발열블록 등 저가의 장비에서도 반응이 가능하여 고가의 유전자증폭기 장비가 필요하지 않다. 그리고 SYBR Green I 을 사용하여 전기영동 없이 육안확인이 가능하기 때문에 인체에 유해한 ethidium bromide (EtBr)을 사용 하지 않고, 현장 및 기타 어느 장소에서도 병원체에 대한 진단이 가능한 장점을 가지고 있다. 본 연구에서는 특이성, 정밀성, 간편성을 갖춘 분자기법 중 하나인 RT-LAMP방법을 이용하여 콩의 중요 바이러스인 SMV, SYMMV, SYCMV의 감염 유무를 신속하게 확인할 수 있는 진단법을 개발하였다.
Soybean mosaic virus (SMV),Soybean yellow mottle mosaic virus (SYMMV), Soybean yellow common mosaic virus (SYCMV) are prevalent plant virus detected in Glycine Max in Korea. So, We have developed Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for rapid detection of SMV,...
Soybean mosaic virus (SMV),Soybean yellow mottle mosaic virus (SYMMV), Soybean yellow common mosaic virus (SYCMV) are prevalent plant virus detected in Glycine Max in Korea. So, We have developed Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for rapid detection of SMV, SYCMV and SYMMV. In this study, we designed primers (SML,SYMM,SYCML-F3/B3/FIP/BIP) specific to sequences from coat protein of virus genome, respectively. Sensitivity analysis showed that RT-LAMP is 10 to 100 times more sensitive than reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The Optimal reaction condition for SMV RT-LAMP was determined at 58℃ for 50min, SYMMV RT-LAMP was determined at 65℃ for 50min and SYCMV RT-LAMP was determined at 63℃ for 50min. The results indicates that RT-LAMP does not require special equipment and long time, therefore it can be an alternative detection method of RT-PCR in laboratory and field.
Soybean mosaic virus (SMV),Soybean yellow mottle mosaic virus (SYMMV), Soybean yellow common mosaic virus (SYCMV) are prevalent plant virus detected in Glycine Max in Korea. So, We have developed Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for rapid detection of SMV, SYCMV and SYMMV. In this study, we designed primers (SML,SYMM,SYCML-F3/B3/FIP/BIP) specific to sequences from coat protein of virus genome, respectively. Sensitivity analysis showed that RT-LAMP is 10 to 100 times more sensitive than reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The Optimal reaction condition for SMV RT-LAMP was determined at 58℃ for 50min, SYMMV RT-LAMP was determined at 65℃ for 50min and SYCMV RT-LAMP was determined at 63℃ for 50min. The results indicates that RT-LAMP does not require special equipment and long time, therefore it can be an alternative detection method of RT-PCR in laboratory and field.
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