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문제 정의
- 본 연구에서는 신속하고 정확하며 비용효율이 높은 검출방법인 RT-LAMP 방법을 이용하여 콩에 문제시되고 있는 SYMMV의 신속검출방법을 제안하고자 하였다.
- 설계된 프라이머의 종 특이성을 확인하기 위해서 주요 콩 바이러스들에 대한 반응 여부를 확인하였다. 6종(SYMMV, SMV, SYCMV, PSV, BCMV, PeMoV) 바이러스의 양성대조구를 이용하여 특이성을 검증하였으며, 실험에 사용된 네 개의 프라이머들(FIP, BIP, F3, B3)에 대한 반응 특이성을 확인하기 위해서 네 개의 프라이머에서 하나 혹은 두 개를 제외하고 반응을 한 후에 기존의 증폭산물과 비교하였다.
제안 방법
- (40 mΜ Tris-HCl, 20 mΜ KCl, 16 mΜ MgSO4, 20 mΜ (NH4)2SO4, 0.2% Tween 20, 1.6 Μ betaine, 2.8 mM deoxynucleoside triphosphate), 5.5 μl distilled water를 혼합하여 최종 25 μl의 반응액을 조성하였다.
- 설계된 프라이머의 종 특이성을 확인하기 위해서 주요 콩 바이러스들에 대한 반응 여부를 확인하였다. 6종(SYMMV, SMV, SYCMV, PSV, BCMV, PeMoV) 바이러스의 양성대조구를 이용하여 특이성을 검증하였으며, 실험에 사용된 네 개의 프라이머들(FIP, BIP, F3, B3)에 대한 반응 특이성을 확인하기 위해서 네 개의 프라이머에서 하나 혹은 두 개를 제외하고 반응을 한 후에 기존의 증폭산물과 비교하였다.
- RT-LAMP가 등온이 유지 되는 모든 기기에서 반응할 수 있는지 알아보기 위해 등온을 유지할 수 있는 기기인 유전자증폭기(BIOER, Hangzhou, China), 항온수조(Daihan LabTech Co., Ltd., Namyangju, Korea), 발열블록(FINEPCR Co., Ltd., Gunpo, Korea)을 이용하여 재현성을 확인하였다.
- RT-LAMP는 Loopamp RNA Amplification Kit (Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 반응을 수행하였다. Total RNA 2 μl와 50 pmol inner primer (FIP, BIP), 5 pmol outer primer (F3, B3), 1 μl Enzyme mix.
- RT-LAMP와 RT-PCR의 민감도를 비교하기 위하여 RT-LAMP와 RT-PCR을 동일한 전체 RNA를 주형으로 260 ng/μl에서 2.6×10–6 ng/μl까지 단계적으로 10배씩 희석하여 반응을 수행하였다.
-
SYMMV 감염주의 수집 및 RT-PCR 진단.
- 각 반응이 끝나고 반응산물은 2% agarose gel상에서 전기영동을 실시한 후, ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 확인하였다. 또한 SYBR Green I (Lonza, Rockland, ME, USA)을 적용하여 튜브 속 색의 변화 또는 발광유무 통해 반응 여부를 육안으로 확인하였다.
- 각 반응이 끝나고 반응산물은 2% agarose gel상에서 전기영동을 실시한 후, ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 확인하였다. 또한 SYBR Green I (Lonza, Rockland, ME, USA)을 적용하여 튜브 속 색의 변화 또는 발광유무 통해 반응 여부를 육안으로 확인하였다. 색의 변화는 일반 광, UV transilluminator (Sage Creation Science Co.
- 반응온도 및 반응시간의 최적조건을 확인하기 위하여 온도조건은 45oC–69.5oC, 시간조건은 10–60분으로 설정하여 반응을 진행하였다.
- 또한 SYBR Green I (Lonza, Rockland, ME, USA)을 적용하여 튜브 속 색의 변화 또는 발광유무 통해 반응 여부를 육안으로 확인하였다. 색의 변화는 일반 광, UV transilluminator (Sage Creation Science Co., Ltd., Beijing, China)에서 반응여부를 확인하였다.
- 종 특이적 프라이머 선발을 위해 National Center for Biotechnology Information GenBank에 등록되어 있는 SYMMV의 염기서열 정보를 수집하였다. 수집된 염기서열 정보는 DNAMAN software version 7.0 (Lynnon Corporation, Vandreuil, QB, Canada)을 이용하여 비교 분석한 후 외피단백질의 염기서열 정보를 이용하여 LAMP 프라이머를 설계하였다. 프라이머는 PrimerExplorer (http://primerexplorer.
- 2014년, 대구광역시 하빈면에 위치한 농촌진흥청 국립식량과학원 남부작물부 대구시험지 유전자 원포에서 모자이크, 얼룩, 황화, 퇴록 등의 전형적인 바이러스 증상을 보이는 콩 잎을 수집하였다. 수집한 시료는 easy-spin RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 제조사의 실험 방법에 따라 전체 RNA를 추출하였으며, 이를 국내 콩에 발생 보고된 바이러스 6종(SMV, SYMMV, SYCMV, Peanut stunt virus [PSV], Bean common mosaic virus [BCMV], Peanut mottle virus [PeMoV])에 대하여 특이적 프라이머를 이용하여 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 진단을 수행하였다(Lee 등, 2013). RT-PCR 진단 결과를 토대로 SYMMV에 단독으로 감염된 시료에 한하여 본 연구의 공시시료로 사용하였다.
- RT-LAMP 방법은 등온에서 단시간에 유전자 증폭이 가능하고, 전기영동 없이도 형광물질을 이용해 바이러스를 검출할 수 있는 이점이 있다. 프라이머는SYMMV coat protein gene의 염기서열을 기반으로 4개의 프라이머를 설계하였다. 실험결과 SYMMV RT-LAMP는 65oC에서 50분간 증폭시켰을 때 최적의 효율을 보였다.
대상 데이터
- 2014년, 대구광역시 하빈면에 위치한 농촌진흥청 국립식량과학원 남부작물부 대구시험지 유전자 원포에서 모자이크, 얼룩, 황화, 퇴록 등의 전형적인 바이러스 증상을 보이는 콩 잎을 수집하였다. 수집한 시료는 easy-spin RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 제조사의 실험 방법에 따라 전체 RNA를 추출하였으며, 이를 국내 콩에 발생 보고된 바이러스 6종(SMV, SYMMV, SYCMV, Peanut stunt virus [PSV], Bean common mosaic virus [BCMV], Peanut mottle virus [PeMoV])에 대하여 특이적 프라이머를 이용하여 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 진단을 수행하였다(Lee 등, 2013).
- 수집한 시료는 easy-spin RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 제조사의 실험 방법에 따라 전체 RNA를 추출하였으며, 이를 국내 콩에 발생 보고된 바이러스 6종(SMV, SYMMV, SYCMV, Peanut stunt virus [PSV], Bean common mosaic virus [BCMV], Peanut mottle virus [PeMoV])에 대하여 특이적 프라이머를 이용하여 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 진단을 수행하였다(Lee 등, 2013). RT-PCR 진단 결과를 토대로 SYMMV에 단독으로 감염된 시료에 한하여 본 연구의 공시시료로 사용하였다.
- 종 특이적 프라이머 선발을 위해 National Center for Biotechnology Information GenBank에 등록되어 있는 SYMMV의 염기서열 정보를 수집하였다. 수집된 염기서열 정보는 DNAMAN software version 7.
- 0 (Lynnon Corporation, Vandreuil, QB, Canada)을 이용하여 비교 분석한 후 외피단백질의 염기서열 정보를 이용하여 LAMP 프라이머를 설계하였다. 프라이머는 PrimerExplorer (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)를 사용하여 제작하였다(Table 1).
이론/모형
- SYMMV는 콩에서 빈번하게 발생하는 바이러스이며, 이 바이러스의 발생률은 계속해서 증가하고 있다. 본 연구에서는 콩에 발생하는 SYMMV를 신속하게 검출하기 위해서 RTLAMP를 적용하였다. RT-LAMP 방법은 등온에서 단시간에 유전자 증폭이 가능하고, 전기영동 없이도 형광물질을 이용해 바이러스를 검출할 수 있는 이점이 있다.
성능/효과
- Primer의 특이성을 확인한 결과, SYMMV에서만 양성반응이 확인되었다(Fig. 3). 또한 네 개의 프라이머들에 대한 작동 특이성을 확인한결과 모든프라이머가 함께 있어야만 프라이머가 작동하여 반응이 일어나는 것이 확인되었다(Fig.
- RT-LAMP는 RT-PCR과 달리 등온에서 증폭이 가능하고 시간을 단축할 수 있는 장점을 가지고 있으며, 이와 같은 장점을 이용하여 농업현장에 RT-LAMP 방법을 적용하기 위해서는 항온수조나 발열블럭등의 장비와같이 이동성과 휴대성이 간편한 장비가 필수적으로 요구된다. RT-LAMP 방법의 중요한 요소 중의 하나인 등온조건을 유지할 수 있는 다양한 기기(유전자증폭기, 항온수조, 발열블록)를 이용하여 재현성을확인한결과, 모든기기에서동일한 RT-LAMP 결과를확인 할 수 있었다(Fig. 6). 또한, 반응 후 전기영동이 아닌 SYBR green I을 이용하여 육안확인이 가능한지 알아보기 위해서 튜브 속 변색 또는 발광유무 통하여 반응 여부를 육안으로 확인한 결과 일반 광, 자외선 모두에서 양성 및 음성 대조군의 구분이 가능하였다(Fig.
- RT-LAMP와 RT-PCR의 민감도를 비교한 결과 RT-LAMP는 2.6×10–5 ng/μl까지 RT-PCR은 2.6×10–4 ng/μl까지 밴드가 형성 되는 것이 확인되었다.
- RT-LAMP의최적반응온도조건을확인한결과 62.8oC 이상에서 반응이 시작되는 것을 확인할 수 있었고, 69.5oC에서는오히려 반응이 저해된 것을 확인하였다(Fig. 1). 62.
- RT-PCR이 주형이 2.6×10–4 ng/μl일 때 매우 희미한 밴드를 형성한 것으로 보아 RT-LAMP가 RT-PCR보다 10–100배의 민감도를 가지고 있는 것으로 확인되었다 (Fig. 5).
- 3). 또한 네 개의 프라이머들에 대한 작동 특이성을 확인한결과 모든프라이머가 함께 있어야만 프라이머가 작동하여 반응이 일어나는 것이 확인되었다(Fig. 4). LAMP primer는 4개의 프라이머가 총 6부분의 염기서열영역과 반응하는데 이는 PCR과 비교하여도 높은 특이성을 나타낼수 있을 것이라 생각된다.
- 또한, RTLAMP와 RT-PCR과의 민감도를 비교한 결과 RT-LAMP 방법이 10–100배 정도 더 우수한 민감도를 가지는 것으로 밝혀졌다.
- 6). 또한, 반응 후 전기영동이 아닌 SYBR green I을 이용하여 육안확인이 가능한지 알아보기 위해서 튜브 속 변색 또는 발광유무 통하여 반응 여부를 육안으로 확인한 결과 일반 광, 자외선 모두에서 양성 및 음성 대조군의 구분이 가능하였다(Fig. 7). 위의 특징을 이용한다면 현장에서 전기영동 없이 증폭산물의 반응유무를 육안으로 간편하게 확인 가능할 것으로생각된다.
- 프라이머는SYMMV coat protein gene의 염기서열을 기반으로 4개의 프라이머를 설계하였다. 실험결과 SYMMV RT-LAMP는 65oC에서 50분간 증폭시켰을 때 최적의 효율을 보였다. 또한, RTLAMP와 RT-PCR과의 민감도를 비교한 결과 RT-LAMP 방법이 10–100배 정도 더 우수한 민감도를 가지는 것으로 밝혀졌다.
- 최적반응시간 조건을 확인한 결과, 반응이 30분이상 되었을 때 처음으로 반응이 확인되었으며, 50분 이상부터 최적의 반응을 보였다(Fig. 2). LAMP 방법은기존의 PCR 방법과 유사하지만 등온조건에서 변성과정없이 접합, 신장이 가능하다(Blomström 등, 2008; Nagamine 등, 2002).
후속연구
- 본 실험 결과를 바탕으로 RT-LAMP는 SYMMV에 대한 신속, 정확한 진단에 적용될 수 있을 것이라 생각된다.
- 또한, RTLAMP와 RT-PCR과의 민감도를 비교한 결과 RT-LAMP 방법이 10–100배 정도 더 우수한 민감도를 가지는 것으로 밝혀졌다. 본 실험 결과를 토대로 기존의 진단법과 비교하여 높은 민감도와 짧은 소요시간에 이점이 있는 RT-LAMP는 SYMMV 의 현장 및 연구실에서의 진단에 적용될 수 있을 것이라 생각된다.
- 7). 위의 특징을 이용한다면 현장에서 전기영동 없이 증폭산물의 반응유무를 육안으로 간편하게 확인 가능할 것으로생각된다.
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