초 록
1987년 일본학자인 Yoshizumi Ishino에 의해 대장균에서 CRISPR가 발견된 이래 DNA를 절단하는 핵산분해효소 (Nuclease)인 Cas9과 결합이 해서 만들어진 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 새로운 방식으로 다양한 형질전환동물을 생산하게 되었다. 이는 흔히 유전자 가위라 불리는 endonuclease splicing 로서 1세대인 Zinc-Finger Nucleases (ZFNs)로부터, 2세대인 Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)보다 효율적이고 손쉽게 유전자를 조작할 수 있는 이점이 있다. 이러한 CRISPR/Cas9 시스템은 특정 유전자 내에 target site와 동일한 sgRNA의 유도에 의해 Cas9의 특정 유전자 내 target site를 공격하여 유전자 삽입과 손실을 일으켜 유전자의 기능을 무력화하는 원리로 작동을 한다. 만약 염색체내 특정 부분의 유전자를 인위적으로 삽입, 손실, 변형 등을 유도할 수 있다면 유전학 및 분자 생물학 연구에 널리 활용할 수 있다.
본 연구의 목적은 고양이 내 인간 HIV-1에 대한 제한 인자 (Restriction Factor)인 APOBEC3 family의 구성원인 fA3H와 fA3CH를 유전적으로 변형시킴으로 인하여 HIV-1감염을 원활하게 하여 AIDS연구에 유용한 고양이를 생산하고자 하는 것이다. 특히, 이 fA3H와 fA3CH는 고양이 체내에서 HIV-1의 감염을 감소하고, 또 HIV-1 아미노산 서열 내 ...
초 록
1987년 일본학자인 Yoshizumi Ishino에 의해 대장균에서 CRISPR가 발견된 이래 DNA를 절단하는 핵산분해효소 (Nuclease)인 Cas9과 결합이 해서 만들어진 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 새로운 방식으로 다양한 형질전환동물을 생산하게 되었다. 이는 흔히 유전자 가위라 불리는 endonuclease splicing 로서 1세대인 Zinc-Finger Nucleases (ZFNs)로부터, 2세대인 Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)보다 효율적이고 손쉽게 유전자를 조작할 수 있는 이점이 있다. 이러한 CRISPR/Cas9 시스템은 특정 유전자 내에 target site와 동일한 sgRNA의 유도에 의해 Cas9의 특정 유전자 내 target site를 공격하여 유전자 삽입과 손실을 일으켜 유전자의 기능을 무력화하는 원리로 작동을 한다. 만약 염색체내 특정 부분의 유전자를 인위적으로 삽입, 손실, 변형 등을 유도할 수 있다면 유전학 및 분자 생물학 연구에 널리 활용할 수 있다.
본 연구의 목적은 고양이 내 인간 HIV-1에 대한 제한 인자 (Restriction Factor)인 APOBEC3 family의 구성원인 fA3H와 fA3CH를 유전적으로 변형시킴으로 인하여 HIV-1감염을 원활하게 하여 AIDS연구에 유용한 고양이를 생산하고자 하는 것이다. 특히, 이 fA3H와 fA3CH는 고양이 체내에서 HIV-1의 감염을 감소하고, 또 HIV-1 아미노산 서열 내 Glycine (G)를 Alanine (A)로의 hyper mutation을 유도한다고 알려져 있다. 우선, fA3H/fA3CH의 유전자 서열을 PCR 증폭과 유전자 분석을 확보하였다. 이 fA3H/fA3CH의 유전자 서열을 바탕으로 특정 target site에 대한 sgRNA oligonucleotides를 디자인하였고 이를 CRISPR/Cas9 플라즈미드인 pX330에 삽입하여 CRISPR/Cas9 플라즈미드인 pX330-fA3H/fA3CH를 완성하였다. 이를 바탕으로 fA3H/fA3CH에 대한 sgRNA mRNA과 Cas9 mRNA를 합성하였다. 이를 이용한 CRISPR/Cas9 mRNA의 유전자 적중 효율을 세포 내에서 확인하기 위해서, 고양이 귀 섬유아세포에 transfection한 결과 pX330-fA3H/fA3CH 플라즈미드(DNA)는 23%, fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA(RNA)는 41%의 유전자 손실 및 삽입 효율을 보였다. 이렇게 구축된 fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA를 이용하여 형질전환 고양이 생산을 위해서 고양이 난자 회수, 체외 성숙, 정자 채취, 그리고 이를 이용한 체외 수정 및 배아 이식 등의 방법 등을 최적화하였다. 특히, 전핵 단계 고양이 초기 배아 내 cytoplasm내에 fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA를 미세 주입하여 배반포 단계까지 발달(22.5%)을 조사하여 최적의 micromanipulation 방법을 구축하였다. 이러한 배반포에서 genomic DNA를 추출하여 PCR-RFLP방법으로 배아 내에서 CRISPR/Cas9시스템의 효율을 조사하였다. 그 결과 24개의 배반포에서 15개 배반포가 유전자 적중됨을 보였으며 (15/24=62.5%), 이중 12개 배반포는 bi-allelic knocked out homozygote이며, 나머지 3개 배반포는 mon-allelic knocked out heterozygote이었다. 이를 바탕으로 fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA를 미세주입 배아를 가임신 된 대리모 고양이 수란관내에 의식하였다. 이후 30일후에 임신여부를 확인하고 60일째 2마리의 대리모 고양이로부터 6마리의 산자를 얻었으며 이중 2마리가 유전자 서열 분석을 통하여 최종적으로 유전자 적중됨을 확인하였다(2/6=33.3%). 이중 한 마리는 fA3H/fA3CH exon 3내 target site에 하나의 뉴클레오타이드가 손실된 bi-allelic knocked out된 고양이이고, 다른 하나는 두개의 뉴클레오타이드가 손실된 mono-allelic knocked out r고양이로 밝혀졌다. 이는 CRISPR/Cas9 시스템으로 유전자 적중 (gene targeting)된 최초의 고양이이고, 특히, HIV-1감염에 의한 AIDS 발병 연구에 중요한 모델 고양이로 사용될 수 있는 최초의 유전자 적중 고양이이다. 이는 CRISPR/Cas9으로 다양한 종류의 유전자에 대한 유전자 적중 및 유전자 삽입 (Knock In)을 가능케 하는 계기가 될 것이다. 특히, 향후 이 fA3H/fA3CH 유전자 적중 고양이를 이용하여 HIV-1 감염에 대한 백신 개발을 가능케 하고 AIDS치료를 위한 항체 생산에 활용도가 높을 것이라 생각된다.
초 록
1987년 일본학자인 Yoshizumi Ishino에 의해 대장균에서 CRISPR가 발견된 이래 DNA를 절단하는 핵산분해효소 (Nuclease)인 Cas9과 결합이 해서 만들어진 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 새로운 방식으로 다양한 형질전환동물을 생산하게 되었다. 이는 흔히 유전자 가위라 불리는 endonuclease splicing 로서 1세대인 Zinc-Finger Nucleases (ZFNs)로부터, 2세대인 Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)보다 효율적이고 손쉽게 유전자를 조작할 수 있는 이점이 있다. 이러한 CRISPR/Cas9 시스템은 특정 유전자 내에 target site와 동일한 sgRNA의 유도에 의해 Cas9의 특정 유전자 내 target site를 공격하여 유전자 삽입과 손실을 일으켜 유전자의 기능을 무력화하는 원리로 작동을 한다. 만약 염색체내 특정 부분의 유전자를 인위적으로 삽입, 손실, 변형 등을 유도할 수 있다면 유전학 및 분자 생물학 연구에 널리 활용할 수 있다.
본 연구의 목적은 고양이 내 인간 HIV-1에 대한 제한 인자 (Restriction Factor)인 APOBEC3 family의 구성원인 fA3H와 fA3CH를 유전적으로 변형시킴으로 인하여 HIV-1감염을 원활하게 하여 AIDS연구에 유용한 고양이를 생산하고자 하는 것이다. 특히, 이 fA3H와 fA3CH는 고양이 체내에서 HIV-1의 감염을 감소하고, 또 HIV-1 아미노산 서열 내 Glycine (G)를 Alanine (A)로의 hyper mutation을 유도한다고 알려져 있다. 우선, fA3H/fA3CH의 유전자 서열을 PCR 증폭과 유전자 분석을 확보하였다. 이 fA3H/fA3CH의 유전자 서열을 바탕으로 특정 target site에 대한 sgRNA oligonucleotides를 디자인하였고 이를 CRISPR/Cas9 플라즈미드인 pX330에 삽입하여 CRISPR/Cas9 플라즈미드인 pX330-fA3H/fA3CH를 완성하였다. 이를 바탕으로 fA3H/fA3CH에 대한 sgRNA mRNA과 Cas9 mRNA를 합성하였다. 이를 이용한 CRISPR/Cas9 mRNA의 유전자 적중 효율을 세포 내에서 확인하기 위해서, 고양이 귀 섬유아세포에 transfection한 결과 pX330-fA3H/fA3CH 플라즈미드(DNA)는 23%, fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA(RNA)는 41%의 유전자 손실 및 삽입 효율을 보였다. 이렇게 구축된 fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA를 이용하여 형질전환 고양이 생산을 위해서 고양이 난자 회수, 체외 성숙, 정자 채취, 그리고 이를 이용한 체외 수정 및 배아 이식 등의 방법 등을 최적화하였다. 특히, 전핵 단계 고양이 초기 배아 내 cytoplasm내에 fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA를 미세 주입하여 배반포 단계까지 발달(22.5%)을 조사하여 최적의 micromanipulation 방법을 구축하였다. 이러한 배반포에서 genomic DNA를 추출하여 PCR-RFLP방법으로 배아 내에서 CRISPR/Cas9시스템의 효율을 조사하였다. 그 결과 24개의 배반포에서 15개 배반포가 유전자 적중됨을 보였으며 (15/24=62.5%), 이중 12개 배반포는 bi-allelic knocked out homozygote이며, 나머지 3개 배반포는 mon-allelic knocked out heterozygote이었다. 이를 바탕으로 fA3H/fA3CH sgRNA와 Cas9 mRNA를 미세주입 배아를 가임신 된 대리모 고양이 수란관내에 의식하였다. 이후 30일후에 임신여부를 확인하고 60일째 2마리의 대리모 고양이로부터 6마리의 산자를 얻었으며 이중 2마리가 유전자 서열 분석을 통하여 최종적으로 유전자 적중됨을 확인하였다(2/6=33.3%). 이중 한 마리는 fA3H/fA3CH exon 3내 target site에 하나의 뉴클레오타이드가 손실된 bi-allelic knocked out된 고양이이고, 다른 하나는 두개의 뉴클레오타이드가 손실된 mono-allelic knocked out r고양이로 밝혀졌다. 이는 CRISPR/Cas9 시스템으로 유전자 적중 (gene targeting)된 최초의 고양이이고, 특히, HIV-1감염에 의한 AIDS 발병 연구에 중요한 모델 고양이로 사용될 수 있는 최초의 유전자 적중 고양이이다. 이는 CRISPR/Cas9으로 다양한 종류의 유전자에 대한 유전자 적중 및 유전자 삽입 (Knock In)을 가능케 하는 계기가 될 것이다. 특히, 향후 이 fA3H/fA3CH 유전자 적중 고양이를 이용하여 HIV-1 감염에 대한 백신 개발을 가능케 하고 AIDS치료를 위한 항체 생산에 활용도가 높을 것이라 생각된다.
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