[논문]벼에서 CRISPR/Cas9 활용 고빈도 유전자 편집 방법

정유진; 배상수; 이긍주; 서필준; 조용구; 강권규

doi:10.5010/jpb.2017.44.1.089

벼에서 CRISPR/Cas9 활용 고빈도 유전자 편집 방법
A novel method for high-frequency genome editing in rice, using the CRISPR/Cas9 system 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.44 no.1, 2017년, pp.89 - 96

정유진 (국립한경대학교 원예생명과학과) , 배상수 (한양대학교 화학과) , 이긍주 (충남대학교 원예학과) , 서필준 (성균관대학교 생명과학과) , 조용구 (충북대학교 식물자원학과) , 강권규 (국립한경대학교 유전공학연구소)

초록
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CRISPR/Cas9 기술은 생명공학을 활용한 신품종 작물육성에 있어 패러다임 변혁을 가져다 줄 핵심 기반기술이다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9를 이용하여 유전자편집기술을 기존에 알려진 방법보다 쉽고 정확하게 실험 할 수 있도록 sgRNA 디자인, 벡터구축, 형질전환체 육성 및 분석 등을 자세히 기술하였다. sgRNA는 http://www.rgenome.net/ 사이트에서 NGG 영역을 중심으로 하여 target-up: 5'-ggcaGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'과 target-down: 5'-aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'의 올리고를 디자인하였다. 식물형질전환용 벡터는 pPZP-Cas9-RGEN을 기본으로 하였으며, sgRNA의 프로모터는 OsU3를 이용하여 pPZP::35S::Cas9::PinII-OsU3::sgRNA::Bar-Gen 순으로 구축하였다. 형질전환체의 육성은 단기형질전환 Agrobacterium 법을 사용하였으며 재분화 식물체를 얻는데48일 정도 소요되었다. 형질전환체 유무는 genomic PCR 분석으로 single copy 선발은 TaqMan PCR로 분석하였다. 정밀유전자편집 식물체는 T1 세대에서 T-DNA 삽입되지 않은 식물체를 Bar-strip에 의해 선발하였다. 선발된 식물체의 sgRNA 영역의 염기배열 조사에 의해 유전자 편집 식물체를 육성하였다. 따라서 본 연구에서 CRISPR/Cas9 system에 의한 정밀유전자편집 기술을 이용하여 보다 빠르고 쉽고 경제적으로 유전자가 편집된 개체를 확보할 수 있었다. 본 실험에서 확립된 system은 상업용 식물 계통육성에 이용 가능하여 육종적 가치가 매우 클 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The CRISPR/Cas9 is a core technology that can result in a paradigm for breeding new varieties. This study describes in detail the sgRNA design, vector construction, and the development of a transgenic plant and its molecular analysis, and demonstrates how gene editing technology through the CRISPR/Cas9 system can be applied easily and accurately. CRISPR/Cas9 facilitates targeted gene editing through RNA-guided DNA cleavage, followed by cellular DNA repair mechanisms that introduce sequence changes at the site of cleavage. It also allows the generation of heritable-targeted gene mutations and corrections. Here, we present detailed procedures involved in the CRISPR/Cas9 system to acquire faster, easier and more cost-efficient gene edited transgenic rice. The protocol described here establishes the strategies and steps for the selection of targets, design of sgRNA, vector construction, and analysis of the transgenic lines. The same principles can be used to customize the versatile CRISPR/Cas9 system, for application to other plant species.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

지금까지 많은 생물에서 CRISPR/Cas9를 이용하여 유전자 편집에 대한 보고는 되었으나 일반적인 연구실에서 적용 및 응용하기가 아직 부족한 실정이다. 본 논문에서는 CRISPR/Cas9을 이용하여 유전자편집기술을 기존에 알려진 방법보다 쉽고 정확하게 실험 할 수 있도록 sgRNA 디자인, 벡터구축, 형질전환체 분석 및 육성 등을 자세히 기술하고자 한다.

제안 방법

sgRNA 종류별 형질전환체는 최소 30개체부터 최대 65개체를 얻었다. 따라서 본 연구에 사용한 형질전환 방법은 Toki et al. (2006)이 발표한 방법을 개량하여 사용한 것으로 단기간에 아주 정확하게 재분화 할 수 있는 것으로 판단된다.
선정된 sgRNA들은 PAM서열을 제외한 20개의 염기를 이용하여 target-up: 5’-ggcaGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 과 target-down: 5’-aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3’ 의 올리고를 디자인 한다. 이때 연속적인 N은 선정된 sgRNA 각각의 염기들을 의미하며, 앞뒤의 소문자로 구성된 어댑터는 삽입될 백터의 OsU3 프로모터영역과 오버행을 갖는 염기들이다.
RGEN 디자인 프로그램은 먼저 선정된 작물의 게놈에서 목표하는 유전자 염기서열 중 CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9) 시스템이 인식하는 부위인 PAM (Proto-Spacer Adjacent Motif) 5’-NGG-3’ 서열을 선정한 후, PAM으로부터 시작하여 역으로 20bp의 sgRNA를 제작하도록 고안되어 있다. 프로그램 사용방법은 사이트 접속 후 Cas-Designer로 들어가서 원하는 PAM type을 선정할 수 있으며, 본 연구에서는 SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5'-NGG-3' 을 선정하였다. 그 다음은 target genome 을 선정하고, 유전자 전체 CDS 중에서 앞쪽부터 50% 정도 되는 서열을 한번에 1,000 bp 이내로 target sequence에 넣은 후 submit를 클릭한다.

성능/효과

1B). 본 실험에서 구축한 CRISPR-Cas9 system은 기존의 벡터보다 구축하기 용이하고 경제적이며 아주 정확하게 만들 수 있다고 생각된다.
총 3개의 유전자 도입 형질전환체들 중 sgRNA1에서는 8개체, sgRNA2 에서는 9개체, sgRNA3에서는 6개체의 single copy를 확인하여 T1 종자를 채종하였다. 이상의 결과로부터 재분화된 식물체의 T-DNA 도입여부를 genomic PCR 및 TaqMan PCR 방법으로 분석하면 쉽고 빠르게 single copy가 삽입된 형질전환체 선발이 가능하다고 생각된다.

후속연구

따라서, 본 연구에서는 정밀 유전자편집 기술인 CRISPR/Cas9 system 을 이용하여 보다 빠르고 쉽고 경제적으로 유전자가 편집된 개체를 확보할 수 있었다. 본 실험에서 확립된 system은 상업용 식물 계통육성에 이용 가능하여 육종적가치가 매우 클 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	RGEN 디자인 프로그램의 사용방법은 무엇인가?	RGEN 디자인 프로그램은 먼저 선정된 작물의 게놈에서 목표하는 유전자 염기서열 중 CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9) 시스템이 인식하는 부위인 PAM (Proto-Spacer Adjacent Motif) 5’-NGG-3’ 서열을 선정한 후, PAM으로부터 시작하여 역으로 20bp의 sgRNA를 제작하도록 고안되어 있다. 프로그램 사용방법은 사이트 접속 후 Cas-Designer로 들어가서 원하는 PAM type을 선정할 수 있으며, 본 연구에서는 SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5'-NGG-3' 을 선정하였다. 그 다음은 target genome 을 선정하고, 유전자 전체 CDS 중에서 앞쪽부터 50% 정도 되는 서열을 한번에 1,000 bp 이내로 target sequence에 넣은 후 submit를 클릭한다. 분석에 의해 얻어진 sgRNA들 중에서는 mis-match 1, 2에서 off-target이 제거된 list 1-0-0으로 나온 것과, 30%~70% 사이의 GC 함량으로 구성되고, out-of-frame score가 높은 것 순으로 선정하는 것이 바람직하다. 이 score는 indel이 일어났을 때 frame-shift가 일어날 가능성을 예측 하여 기록한 것으로 높을수록 염기에 변이가 일어날 가능성이 높다고 볼 수 있다. 이렇게 선정된 sgRNA들은 한번 더 Cas-OFFinder로 들어가서 넣은 후 mis-match 설정을 3 ~ 4개로 하여 off-target들을 찾아내어 list 1-0-0-0을 골라낸다. Off-target이 많으면 원하지 않는 변이가 생길 가능성이 높으 므로 신중히 선택하는 것이 좋다. 최종 선정된 sgRNA들 중에서 한 유전자당 4 ~ 5개를 선정하여 사용한다.
	게놈편집은 어떠한 기술인가?	최근 다양한 생물 종에서 목적하는 유전자를 개량하는 기술로 “게놈편집”이 주목 받고 있다. 특히 인공제한효소를 이용한 게놈편집은 광범위한 생물 종에서 표적유전자 파괴 (Knock-out) 및 외래유전자의 부가(knock-in)가 가능하게 되면서부터 차세대 유전자 개량기술로 주목을 받고 있다 (Subburaj et al.
	CRISPR/Cas9 활용시 어떠한 편집이 가능한가?	최근 들어 세균 획득 면역반응 system (CRISPR/Cas9(clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated protein 9)은 염기서열 특이적 핵산분해효소로서 작용할 수 있는 일종의 맞춤형 유전자가위이다. CRISPR/Cas9 활용을 통해 특정염기서열을 인지하고 그 부위의 이중나선을 절단함으로써 유전체상 위치 특이적 돌연변이 유도, 유전자삽입, 대체 등을 포함한 다양한 염기서열 특이적 유전체 편집이 가능 하다(Endo et al. 2016; Wang et al.

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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