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제 1 부. 재조합 대장균으로부터 베타카로틴(β-carotene)의 생합성과 추출 및 이의 주름개선효과

재조합 대장균으로부터 합성된 베타-카로틴(β-carotene)을 추출, 정제하고 이의 주름개선 효과를 평가하였다. 탈수용매, 추출용매에 따른 추출량의 큰 변화는 발견되지 않았으나, wet-cell cake으로부터 추출한 경우가 dry cell로부터 추출한 경우에 비하여 2배 많은 양의 베타-카로틴(β-carotene)이 추출되었다. 5 g의 wet-cell cake을 파쇄하고, 아세톤으로 탈수한 후, 아이소부틸 ...

제 1 부. 재조합 대장균으로부터 베타카로틴(β-carotene)의 생합성과 추출 및 이의 주름개선효과

재조합 대장균으로부터 합성된 베타-카로틴(β-carotene)을 추출, 정제하고 이의 주름개선 효과를 평가하였다. 탈수용매, 추출용매에 따른 추출량의 큰 변화는 발견되지 않았으나, wet-cell cake으로부터 추출한 경우가 dry cell로부터 추출한 경우에 비하여 2배 많은 양의 베타-카로틴(β-carotene)이 추출되었다. 5 g의 wet-cell cake을 파쇄하고, 아세톤으로 탈수한 후, 아이소부틸 아세테이트(isobutyl acetate)로 추출한 결과 36 mg의 베타-카로틴(β-carotene)이 추출되었는데, 이는 61.2% 회수율에 해당한다. 베타-카로틴(β-carotene)의 결정을 생성시키고 이를 분리한 결과 순도가 증가하였다. 재조합 대장균 배양액 2.5 L로부터 얻은 wet-cell cake 223 g의 탈수, 세포파쇄 후 세포잔사물로부터 베타-카로틴(β-carotene) 추출, 농축, 결정화 등을 통하여 최종적으로 순도 88%인 베타-카로틴(β-carotene) 결정 633 mg을 얻었다.

재조합 대장균으로부터 고순도 베타-카로틴(β-carotene)을 효율적으로 회수하기 위한 추출정제 방법을 개발하기 위하여 세포파쇄의 유무，추출은도，추출용매의 종류，세포 대 추출용매의 비율 및 결정세척 용매의 선정이 베타-카로틴(β-carotene) 추출수율과 순도에 미치는 영향을 조사하였다. 세포파쇄의 유무는 베타-카로틴(β-carotene) 추출수율에 영향을 미치지 않았으므로 별도의 물리적 세포파쇄 단계가 생략되었다. 테스트된 용매 종류에 관계없이 50 °C에서 베타-카로틴(β-carotene)의 추출수율은 30 °C에서보다 월등히 높았다. 아이소부틸 아세테이트(isobutyl acetate)에 의해 추출되는 베타-카로틴의 양은 추출성능이 제일 낮은 아세톤을 사용한 경우에 비해 7.6배 높았다. 0.4 g의 동결건조세포로부터 베타-카로틴을 최대로 추출하기 위해 필요한 아이소부틸 아세테이트(isobutyl acetate)의 최적양은 10 mL였고，이는 단위 건조 세포(g-diy cells) 당 25 ml 아이소부틸 아세테이트(isobutyl acetate)가 필요함을 의미하였다. 아세톤과 올리브오일을 동일비율로 혼합한 용액에 의한 추출 양은 아세톤만을 사용한 경우보다 훨씬 높았고 가장 높은 값을 나타낸 아이소부틸 아세테이트(isobutyl acetate)에 의한 값과 비슷한 수치를 나타내었다. 추출액에 용해되어 있는 베타-카로틴(β-carotene)의 결정 생성을 촉진시켜 베타-카로틴을 추출용액으로 분리하여 얻어진 베타-카로틴 결정의 순도는 88.6%으나 이를 에탄올로 세척 시 순도가 98.5%로 향상되었다. HPLC, 분광광도계 분석 외에 추가적으로 질량분석을 수행함으로써 회수된 결정이 베타-카로틴(β-carotene)임을 확인하였다. 이와 같은 결과는 본 연구자가 개발한 방법으로 식품의약품안전처에서 고시한 화장품 및 식품의 첨가물 기준을 만족시키는 고 순도 베타-카로틴(β-carotene)을 효율적으로 생산할 수 있음을 시사한다.

사람섬유아세포 배양을 통하여 정제된 베타-카로틴(β-carotene)의 세포독성 및 콜라겐 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 1.7 μM의 베타-카로틴(β-carotene)을 첨가 시 세포에 독성을 거의 나타내지 않았으며 콜라겐 합성양은 첨가하지 않은 경우에 비하여 1.4배 증가하였다. 본 결과는 저유독성 용매를 사용하고 기존보다 간단한 방법을 사용하여 재조합 대장균으로부터 고 순도의 베타-카로틴(β-carotene)을 정제할 수 있고 이를 기능성화장품의 주름개선제로 사용될 수 있음을 시사한다.

제 2 부. 재조합 대장균 유래 베타카로틴이 함유된 기능성 화장품 제조 및 이의 임상실험을 통한 주름개선 효능 평가

재조합 대장균으로부터 회수된 고 순도 베타-카로틴(β-carotene)을 첨가한 기능성 화장품의 제조방법을 개발하고 이의 임상실험을 수행하여 개발된 화장품의 주름개선 성능을 평가하였다. 베타-카로틴(β-carotene)의 유효성, 각종 피부흡수 및 사용성, 질감 등을 고려하여 화장품을 처방하였다. 베타-카로틴(β-carotene)의 첨가량은 피부에 독성을 나타내지 않고 콜라겐생합성 촉진효과가 우수하며 베타카로틴 자체의 특유한 붉은 색소가 피부에 묻어나오지 않을 정도인 화장품 kg 당 1 mg으로 결정하였다. 베타-카로틴(β-carotene)을 용해시키기 위하여 식용오일을 사용하였고 항산화물질인 vitamin E (tocopheryl acetate)를 첨가함으로써 제품의 장기간 보관 시 베타-카로틴(β-carotene)의 안정성과 유효성에 도움을 주게 하였다. 유화제 및 유화안정제는 2.0% 첨가함으로써 유상과 수상이 분리되지 않도록 하였다. 유연제인 dimethicone을 0.35% 첨가함으로써 백탁 현상을 제거하고 피부에 대한 사용감을 좋게 하였다. 보습작용을 보이는 sorbitol을 첨가함으로써, 건조한 환경에 대한 피부트러블을 최소화하게 하였다. 제품의 안정도를 조사하였다. 60일간의 실험에서 상온에 보관된 제품의 pH는 변화가 거의 없었고 0 ℃, 25 ℃, 40 ℃의 온도서 물리·화학적 변화가 없는 안정한 상태를 유지하였다. 뿐만 아니라 광제품의 주름개선 성능을 평가하기 위하여 20명의 피시험자를 대상으로 식품의약품안전처의 유효성가이드라인을 통하여 화장품의 인체적용시험을 실시하였다. 시험자의 평가결과 4주 후 피험자의 38%가 주름이 감소하였고 8주 후에는 68%가 주름이 개선되었다.

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