인플루엔자 A 바이러스는 8개의 유전자를 지질 (lipid)이 감싸고 있는 외피성 (enveloped) 음성 단일 가닥 (negative-sense single stranded) RNA 바이러스이다. 일반적으로 조류와 포유류에 발열, 기침, 오한 등을 동반하는 독감 증상을 보이는 호흡기 질환을 일으키지만, 유전자의 대변이 (genetic shift)나 유전자의 소변이 (genetic drift)를 통해 강화된 병독성 (virulence)과 감염력 (infectivity)을 획득하고, 이것이 인체 감염성을 가지게 되면 전세계적 대유행성 전염병을 뜻하는 판데믹 (...
인플루엔자 A 바이러스는 8개의 유전자를 지질 (lipid)이 감싸고 있는 외피성 (enveloped) 음성 단일 가닥 (negative-sense single stranded) RNA 바이러스이다. 일반적으로 조류와 포유류에 발열, 기침, 오한 등을 동반하는 독감 증상을 보이는 호흡기 질환을 일으키지만, 유전자의 대변이 (genetic shift)나 유전자의 소변이 (genetic drift)를 통해 강화된 병독성 (virulence)과 감염력 (infectivity)을 획득하고, 이것이 인체 감염성을 가지게 되면 전세계적 대유행성 전염병을 뜻하는 판데믹 (pandemic)을 야기하게 된다. 본 연구의 목적은 마우스를 이용하여 인플루엔자 A 바이러스의 병독성 변화를 유도하고 기전을 규명하고자 하는 것이다. 인플루엔자 A 바이러스 중에 A/Hong Kong/68/8 (H3N2; HK-P0)을 이용하여 마우스에 15번의 계대 감염을 통해 얻어진 바이러스 (HK-P15)가 마우스에 대한 반수치사량 (LD50)이 42배 강화되었음을 확인하였다. 강화된 마우스 병독성에 대한 인자를 규명하기 위하여 HK-P15 바이러스에서 네 개의 단일 클론 바이러스를 분리하여 마우스 병독성을 비교한 결과, 두 개의 바이러스 분리주에 의하여 각각 15, 20배 강화되었음을 확인하였다. 단일 클론 바이러스 유전자의 전장 염기서열 분석 (full sequencing) 결과를 토대로 역유전학 실험 기법 (reverse-genetics system)을 이용하여 생성된 유전자 단일 변이 바이러스의 마우스 병독성을 비교한 결과, Nonstructural Protein 1 (NS1) 단백질의 180번 아미노산인 발린이 아데닌으로 변이된 바이러스 (HK-NS1(V180A))와 PB2 단백질의 377번 아미노산인 알라닌이 글루탐산으로 변이된 바이러스 (HK-PB2(A377E))에 의해 강화되었음을 확인하였다. 또한, 바이러스에 감염된 마우스 폐에서의 viral RNA와 단백질 정량 비교, 그리고 조직학 분석을 통하여 유전자 변이에 의해 변화된 바이러스 증식과 병변성의 상관관계를 증명하였다. 본 연구에서는 인플루엔자 A 바이러스에서 NS1 유전자의 V180A 변이에 의하여 강화된 마우스 병독성을 보이고, PB2 유전자의 A377E 변이에 의하여 더욱 강화됨을 규명하였다. 이러한 연구결과는 마우스를 포함한 다양한 포유류에서의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 병원성을 예측하고 방어하는 데 활용될 뿐만 아니라, 효율적인 감염 동물 모델을 구축함으로써 향후 치료제 및 백신 연구 기반에 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
인플루엔자 A 바이러스는 8개의 유전자를 지질 (lipid)이 감싸고 있는 외피성 (enveloped) 음성 단일 가닥 (negative-sense single stranded) RNA 바이러스이다. 일반적으로 조류와 포유류에 발열, 기침, 오한 등을 동반하는 독감 증상을 보이는 호흡기 질환을 일으키지만, 유전자의 대변이 (genetic shift)나 유전자의 소변이 (genetic drift)를 통해 강화된 병독성 (virulence)과 감염력 (infectivity)을 획득하고, 이것이 인체 감염성을 가지게 되면 전세계적 대유행성 전염병을 뜻하는 판데믹 (pandemic)을 야기하게 된다. 본 연구의 목적은 마우스를 이용하여 인플루엔자 A 바이러스의 병독성 변화를 유도하고 기전을 규명하고자 하는 것이다. 인플루엔자 A 바이러스 중에 A/Hong Kong/68/8 (H3N2; HK-P0)을 이용하여 마우스에 15번의 계대 감염을 통해 얻어진 바이러스 (HK-P15)가 마우스에 대한 반수치사량 (LD50)이 42배 강화되었음을 확인하였다. 강화된 마우스 병독성에 대한 인자를 규명하기 위하여 HK-P15 바이러스에서 네 개의 단일 클론 바이러스를 분리하여 마우스 병독성을 비교한 결과, 두 개의 바이러스 분리주에 의하여 각각 15, 20배 강화되었음을 확인하였다. 단일 클론 바이러스 유전자의 전장 염기서열 분석 (full sequencing) 결과를 토대로 역유전학 실험 기법 (reverse-genetics system)을 이용하여 생성된 유전자 단일 변이 바이러스의 마우스 병독성을 비교한 결과, Nonstructural Protein 1 (NS1) 단백질의 180번 아미노산인 발린이 아데닌으로 변이된 바이러스 (HK-NS1(V180A))와 PB2 단백질의 377번 아미노산인 알라닌이 글루탐산으로 변이된 바이러스 (HK-PB2(A377E))에 의해 강화되었음을 확인하였다. 또한, 바이러스에 감염된 마우스 폐에서의 viral RNA와 단백질 정량 비교, 그리고 조직학 분석을 통하여 유전자 변이에 의해 변화된 바이러스 증식과 병변성의 상관관계를 증명하였다. 본 연구에서는 인플루엔자 A 바이러스에서 NS1 유전자의 V180A 변이에 의하여 강화된 마우스 병독성을 보이고, PB2 유전자의 A377E 변이에 의하여 더욱 강화됨을 규명하였다. 이러한 연구결과는 마우스를 포함한 다양한 포유류에서의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 병원성을 예측하고 방어하는 데 활용될 뿐만 아니라, 효율적인 감염 동물 모델을 구축함으로써 향후 치료제 및 백신 연구 기반에 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Influenza A virus is an enveloped virus with eight negative-sense, single-stranded RNAs and belongs to the family Orthomyxoviridae. It causes respiratory disease with flu symptoms not only in birds but also in mammals and acquires increased virulence and infectivity by genetic shift or genetic drift...
Influenza A virus is an enveloped virus with eight negative-sense, single-stranded RNAs and belongs to the family Orthomyxoviridae. It causes respiratory disease with flu symptoms not only in birds but also in mammals and acquires increased virulence and infectivity by genetic shift or genetic drift, occasionally leading to human pandemic or epidemic. The objective of this study was to investigate the molecular determinants responsible for influenza viral pathogenesis and virulence. To obtain lethal strains to Balb/c mouse, we repeated infection of influenza A virus to mice and anlyzed viral whole genome sequence at the final stage. When compared to the wild-type A/Hong Kong/68/8 (H3N2; HK-P0), a pool of mouse-adapted strains at passage 15 (HK-P15) showed 42-fold increased lethality. To identify the viral factors for the increased lethality, four representative viral isolates (HK-P15A, -P15B, -P15C, -P15D) were prepared by plaque purification. Interestingly, infection of mice withHK-P15B and –P15D reduced 50% lethal dose (LD50) by 15 and 20-fold,
* A Thesis for the degree of Master in August 2016.
respectively, while the other two isolates, HK-P15A and –P15C, did not affect lethality. Sequencing analysis informed that within HK-P15B and –P15D, four amino acid mutations (A377E in PB2, M744T in PB1, V180A, and M235I in NS1) could be responsible for the observed virulence. Accordingly, we prepared four recombinant influenza A viruses that contain a single amino acid mutation by reverse genetics system and compared their virulence upon mouse infection. It was observed that the virus with a valine-to-alanine mutation at position 180 of NS1 caused mouse lethality most dramatically among them (67% dead). It is noteworthy that even though the recombinant virus with a mutation of alanine to glutamic acid at amino acid 377 in PB2 showed no effect on lethality, combination of these two mutations further decreased the mouse survival rate (100% dead). Given that these two mutations co-exist in the viral isolate HK-P15B, it can be suggested that they play a role for causing mouse virulence synergistically by reducing innate immune response by the mutant NS1 as well as by upregulating viral RNA replication efficiency by the mutant PB2. Moreover, the relationship between of mouse lethality and these two amino acid mutations were confirmed again by histological analysis and molecular biological studies using influenza A virus-infected mouse lung tissues. The present study suggests that the mutations of V180A in NS1 and A377E in PB2 are major determinants for virulence in mammals. This finding could be applied to prediction of pathogenicity of an emerging or re-emerging influenza A viruses and to defense against influenza pandemics. In addition, the mouse-adapted influenza viral strain, HK-P15B, could be useful for evaluation of efficacy of antiviral or vaccine candidates in vivo.
Influenza A virus is an enveloped virus with eight negative-sense, single-stranded RNAs and belongs to the family Orthomyxoviridae. It causes respiratory disease with flu symptoms not only in birds but also in mammals and acquires increased virulence and infectivity by genetic shift or genetic drift, occasionally leading to human pandemic or epidemic. The objective of this study was to investigate the molecular determinants responsible for influenza viral pathogenesis and virulence. To obtain lethal strains to Balb/c mouse, we repeated infection of influenza A virus to mice and anlyzed viral whole genome sequence at the final stage. When compared to the wild-type A/Hong Kong/68/8 (H3N2; HK-P0), a pool of mouse-adapted strains at passage 15 (HK-P15) showed 42-fold increased lethality. To identify the viral factors for the increased lethality, four representative viral isolates (HK-P15A, -P15B, -P15C, -P15D) were prepared by plaque purification. Interestingly, infection of mice withHK-P15B and –P15D reduced 50% lethal dose (LD50) by 15 and 20-fold,
* A Thesis for the degree of Master in August 2016.
respectively, while the other two isolates, HK-P15A and –P15C, did not affect lethality. Sequencing analysis informed that within HK-P15B and –P15D, four amino acid mutations (A377E in PB2, M744T in PB1, V180A, and M235I in NS1) could be responsible for the observed virulence. Accordingly, we prepared four recombinant influenza A viruses that contain a single amino acid mutation by reverse genetics system and compared their virulence upon mouse infection. It was observed that the virus with a valine-to-alanine mutation at position 180 of NS1 caused mouse lethality most dramatically among them (67% dead). It is noteworthy that even though the recombinant virus with a mutation of alanine to glutamic acid at amino acid 377 in PB2 showed no effect on lethality, combination of these two mutations further decreased the mouse survival rate (100% dead). Given that these two mutations co-exist in the viral isolate HK-P15B, it can be suggested that they play a role for causing mouse virulence synergistically by reducing innate immune response by the mutant NS1 as well as by upregulating viral RNA replication efficiency by the mutant PB2. Moreover, the relationship between of mouse lethality and these two amino acid mutations were confirmed again by histological analysis and molecular biological studies using influenza A virus-infected mouse lung tissues. The present study suggests that the mutations of V180A in NS1 and A377E in PB2 are major determinants for virulence in mammals. This finding could be applied to prediction of pathogenicity of an emerging or re-emerging influenza A viruses and to defense against influenza pandemics. In addition, the mouse-adapted influenza viral strain, HK-P15B, could be useful for evaluation of efficacy of antiviral or vaccine candidates in vivo.
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