[학위논문]Soybean Yellow Common Mosaic Virus 유래 벡터의 개발 및 신종 식물바이러스 발견을 위한 차세대염기서열분석법의 활용 Development of Soybean Yellow Common Mosaic Virus-derived Vectors and Application of Next Generation Sequencing for Discovery of Novel Plant Viruses원문보기
콩에서 발견된 신종바이러스인 Soybean yellow common mosaic virus (SYCMV)를 이용하여 T7 프로모터 (pSYCMVT7-full) 또는 Cauliflower mosaic virus 35S 프로모터 (pSYCMV-full)에 의해서 발현되는 감염성 클론을 제작하였었다. 자연상에서 SYCMV에 감염된 콩 잎과 두 가지 감염성 클론에 접종된 콩 잎에서 야기되는 바이러스 병징의 정도는 거의 동일하였다. 따라서, pSYCMV-full 클론을 이용하여 콩에서 유전자 기능을 분석할 수 있는 ...
콩에서 발견된 신종바이러스인 Soybean yellow common mosaic virus (SYCMV)를 이용하여 T7 프로모터 (pSYCMVT7-full) 또는 Cauliflower mosaic virus 35S 프로모터 (pSYCMV-full)에 의해서 발현되는 감염성 클론을 제작하였었다. 자연상에서 SYCMV에 감염된 콩 잎과 두 가지 감염성 클론에 접종된 콩 잎에서 야기되는 바이러스 병징의 정도는 거의 동일하였다. 따라서, pSYCMV-full 클론을 이용하여 콩에서 유전자 기능을 분석할 수 있는 VIGS (virus-induced gene silencing)벡터를 제작하였다. SYCMV 유래 VIGS 벡터의 활용도를 측정하기 위해서 Phytoene desaturase (PDS) gene (pSYCMV-PDS1)과 small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RbcS) gene (pSYCMV-RbcS2)을 이용하였다. 그 결과, pSYCMV-PDS1 벡터로 접종된 콩에서는 백화현상을 확인할 수 있었으며, pSYCMV-RbcS2 벡터로 접종된 콩에서는 황화 및 옅은 녹색의 표현형을 확인할 수 있었다. 표현형이 변화된 샘플들을 northern blotting으로 확인해 본 결과, 해당 유전자의 전사체 발현량이 pSYCMV-full로 접종된 대조군과 비교해서 상당히 감소되어 있음을 확인할 수 있었다. 바이러스 유래 벡터를 식물에 접종할 때 주로 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 이용하는데, 본 연구에서는 유전자총법 (gene gun/particle bombardment)과 direct plasmid DNA rubbing법도 실시하여 대체방법들의 활용 가능성을 확인하였다. SYCMV 유래 벡터를 콩에서 외래 단백질을 발현하는 도구로써 활용하기 위해서, 구제역바이러스 (Foot-and-mouth disease virus, FMDV) serotype O1 Campos (O1C)의 항원결정기인 VP1 (아미노산 서열 135-160)을 이용하였다 (pSYCMV-FMDV). pSYCMV-FMDV에 접종된 콩은 pSYCMV-full로 접종된 콩처럼 병징이 야기되었으며, western blotting을 통해서 해당 항원결정기 단편의 단백질 발현을 확인할 수 있었다. 바이러스는 살아있는 생물체에서 생활환을 지속할 수 있는 순활물 기생체이다. 식물에 병을 야기하는 바이러스를 진단하기 위해서 혈청학적 방법인 효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay)과 분자생물학적 방법인 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction), 고리매개 등온증폭법 (loop-mediated isothermal amplification), 올리고칩 (oligonucleotide chip) 등이 개발되어 이용되고 있다. 최근에는 차세대염기서열분석법 (next-generation sequencing, NGS)과 분석 파이프라인 (analysis pipeline)을 식물에 감염하는 신종 또는 변종 바이러스의 진단에 응용하고 있다. 따라서, 본 연구에서는 바이러스 감염 병징을 보이는 총 234개의 식물 샘플들을 NGS를 이용한 진단 시스템을 활용하여 두 차례에 나누어 실험을 진행하였다. 두 번의 실험에서 얻은 metatranscriptome data를 분석한 결과, 700개 이상의 식물바이러스 관련 컨티그를 얻을 수 있었으며 182개에 대해서는 개별 식물샘플에서의 확인이 이루어졌다. 그 결과, 현재까지 17개 식물 종으로부터 19개의 신종 식물바이러스가 확인이 되었다. 신종 뿐만 아니라 많은 수의 변종 바이러스도 확인할 수 있었으며, 잘 알려져 있는 식물바이러스에서 유래된 컨티그도 상당 부분을 차지하고 있었다. 변종을 포함하여 알려져 있는 바이러스들의 대부분이 새로운 기주 혹은 새로운 지역적 장소 (한국)에서 최초로 진단 된 것으로써 의미를 가지고 있었으며, 이러한 바이러스들의 지놈 분석을 통해서 식물바이러스 병역학에 대한 이해를 높일 수 있을 것이다. 모든 결과들을 종합해볼 때, 자연계에 존재하는 다양한 식물 종에는 가늠할 수 없을 정도로 많은 미지의 바이러스가 존재하고 있음을 짐작할 수 있으며, 이를 탐색함에 있어서 NGS를 활용한 진단 시스템이 기존 진단법들의 단점을 매우 효율적으로 보완하는 대안이 될 수 있을 것이다.
콩에서 발견된 신종바이러스인 Soybean yellow common mosaic virus (SYCMV)를 이용하여 T7 프로모터 (pSYCMVT7-full) 또는 Cauliflower mosaic virus 35S 프로모터 (pSYCMV-full)에 의해서 발현되는 감염성 클론을 제작하였었다. 자연상에서 SYCMV에 감염된 콩 잎과 두 가지 감염성 클론에 접종된 콩 잎에서 야기되는 바이러스 병징의 정도는 거의 동일하였다. 따라서, pSYCMV-full 클론을 이용하여 콩에서 유전자 기능을 분석할 수 있는 VIGS (virus-induced gene silencing) 벡터를 제작하였다. SYCMV 유래 VIGS 벡터의 활용도를 측정하기 위해서 Phytoene desaturase (PDS) gene (pSYCMV-PDS1)과 small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RbcS) gene (pSYCMV-RbcS2)을 이용하였다. 그 결과, pSYCMV-PDS1 벡터로 접종된 콩에서는 백화현상을 확인할 수 있었으며, pSYCMV-RbcS2 벡터로 접종된 콩에서는 황화 및 옅은 녹색의 표현형을 확인할 수 있었다. 표현형이 변화된 샘플들을 northern blotting으로 확인해 본 결과, 해당 유전자의 전사체 발현량이 pSYCMV-full로 접종된 대조군과 비교해서 상당히 감소되어 있음을 확인할 수 있었다. 바이러스 유래 벡터를 식물에 접종할 때 주로 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 이용하는데, 본 연구에서는 유전자총법 (gene gun/particle bombardment)과 direct plasmid DNA rubbing법도 실시하여 대체방법들의 활용 가능성을 확인하였다. SYCMV 유래 벡터를 콩에서 외래 단백질을 발현하는 도구로써 활용하기 위해서, 구제역바이러스 (Foot-and-mouth disease virus, FMDV) serotype O1 Campos (O1C)의 항원결정기인 VP1 (아미노산 서열 135-160)을 이용하였다 (pSYCMV-FMDV). pSYCMV-FMDV에 접종된 콩은 pSYCMV-full로 접종된 콩처럼 병징이 야기되었으며, western blotting을 통해서 해당 항원결정기 단편의 단백질 발현을 확인할 수 있었다. 바이러스는 살아있는 생물체에서 생활환을 지속할 수 있는 순활물 기생체이다. 식물에 병을 야기하는 바이러스를 진단하기 위해서 혈청학적 방법인 효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay)과 분자생물학적 방법인 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction), 고리매개 등온증폭법 (loop-mediated isothermal amplification), 올리고칩 (oligonucleotide chip) 등이 개발되어 이용되고 있다. 최근에는 차세대염기서열분석법 (next-generation sequencing, NGS)과 분석 파이프라인 (analysis pipeline)을 식물에 감염하는 신종 또는 변종 바이러스의 진단에 응용하고 있다. 따라서, 본 연구에서는 바이러스 감염 병징을 보이는 총 234개의 식물 샘플들을 NGS를 이용한 진단 시스템을 활용하여 두 차례에 나누어 실험을 진행하였다. 두 번의 실험에서 얻은 metatranscriptome data를 분석한 결과, 700개 이상의 식물바이러스 관련 컨티그를 얻을 수 있었으며 182개에 대해서는 개별 식물샘플에서의 확인이 이루어졌다. 그 결과, 현재까지 17개 식물 종으로부터 19개의 신종 식물바이러스가 확인이 되었다. 신종 뿐만 아니라 많은 수의 변종 바이러스도 확인할 수 있었으며, 잘 알려져 있는 식물바이러스에서 유래된 컨티그도 상당 부분을 차지하고 있었다. 변종을 포함하여 알려져 있는 바이러스들의 대부분이 새로운 기주 혹은 새로운 지역적 장소 (한국)에서 최초로 진단 된 것으로써 의미를 가지고 있었으며, 이러한 바이러스들의 지놈 분석을 통해서 식물바이러스 병역학에 대한 이해를 높일 수 있을 것이다. 모든 결과들을 종합해볼 때, 자연계에 존재하는 다양한 식물 종에는 가늠할 수 없을 정도로 많은 미지의 바이러스가 존재하고 있음을 짐작할 수 있으며, 이를 탐색함에 있어서 NGS를 활용한 진단 시스템이 기존 진단법들의 단점을 매우 효율적으로 보완하는 대안이 될 수 있을 것이다.
Soybean yellow common mosaic virus (SYCMV)-derived vectors, including the SYCMV full-length infectious clones driven by the T7 promoter (pSYCMVT7-full) or Cauliflower mosaic virus 35S promoter (pSYCMV-full), were constructed. The symptoms observed in the soybeans infected with either crude sap extra...
Soybean yellow common mosaic virus (SYCMV)-derived vectors, including the SYCMV full-length infectious clones driven by the T7 promoter (pSYCMVT7-full) or Cauliflower mosaic virus 35S promoter (pSYCMV-full), were constructed. The symptoms observed in the soybeans infected with either crude sap extracts of SYCMV-infected leaves or each infectious clone were indistinguishable. The pSYCMV-full vector was modified to use as the virus-induced gene silencing (VIGS) vector for gene function study in soybean. VIGS constructs containing either a fragment of the Phytoene desaturase (PDS) gene (pSYCMV-PDS1) or a fragment of the small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RbcS) gene (pSYCMV-RbcS2) were tested. Soybeans infiltrated with each VIGS construct through the Agrobacterium-mediated inoculation exhibited photo-bleaching in plants infiltrated with pSYCMV-PDS1 and yellow or pale green coloring in plants infiltrated with pSYCMV-RbcS2. In addition, northern blot analysis confirmed down-regulation of the transcripts of the two target genes. Particle bombardment and direct plasmid DNA rubbing were tested as alternative inoculation methods. To determine if the SYCMV vector can be used for the expression of heterologous proteins in soybean, the vector encoding amino acids 135-160 of VP1 of Foot-and-mouth disease virus (FMDV) serotype O1 Campos (O1C) was constructed (pSYCMV-FMDV). Western blot analysis confirmed accumulation of the heterologous protein in plants infiltrated with pSYCMV-FMDV. Viruses are obligate parasites which survive in living organisms. Many diagnostic methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay, reverse transcription-polymerase chain reaction, loop-mediated isothermal amplification and oligonucleotide chip, have been widely used for diagnosis of plant virus diseases. Recently, the new technology, including next-generation sequencing (NGS) and analysis pipeline, for discovery of novel/variant viruses from plant samples has been developed and used. In this study, a total of 234 plant samples, including herbaceous and woody plants showing viral disease-like symptoms, were collected and tested using the NGS-based diagnostic system through two separate experiments. By analyzing the metatranscriptome data obtained from the two experiments, more than 700 contigs related to plant viruses, which contain DNA or RNA virus-like sequences such as positive- or negative-sense ssRNA virus, dsRNA virus, circular ssDNA virus, and reverse-transcribing circular dsDNA virus, were obtained, and 182 contigs have been confirmed in the individual plant samples to date. As a result, 19 putative novel viruses from 17 plant species have been identified. In addition, many highly divergent isolates of known viruses were also identified as well as new viral species, and a great part of contigs had high sequence similarities with known plant viruses. The natural infections of most known viruses with highly divergent genomes or not were first detected in new hosts or new geographic location (Korea), and molecular characterizations of these viruses would be useful in terms of the epidemiology of pathogenic plant viruses. These results indicate that a great amount of unknown or variant plant viruses would exist in all kinds of plants and paired-end RNA sequencing could be a useful tool for the detection of all type of plant viruses.
Soybean yellow common mosaic virus (SYCMV)-derived vectors, including the SYCMV full-length infectious clones driven by the T7 promoter (pSYCMVT7-full) or Cauliflower mosaic virus 35S promoter (pSYCMV-full), were constructed. The symptoms observed in the soybeans infected with either crude sap extracts of SYCMV-infected leaves or each infectious clone were indistinguishable. The pSYCMV-full vector was modified to use as the virus-induced gene silencing (VIGS) vector for gene function study in soybean. VIGS constructs containing either a fragment of the Phytoene desaturase (PDS) gene (pSYCMV-PDS1) or a fragment of the small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RbcS) gene (pSYCMV-RbcS2) were tested. Soybeans infiltrated with each VIGS construct through the Agrobacterium-mediated inoculation exhibited photo-bleaching in plants infiltrated with pSYCMV-PDS1 and yellow or pale green coloring in plants infiltrated with pSYCMV-RbcS2. In addition, northern blot analysis confirmed down-regulation of the transcripts of the two target genes. Particle bombardment and direct plasmid DNA rubbing were tested as alternative inoculation methods. To determine if the SYCMV vector can be used for the expression of heterologous proteins in soybean, the vector encoding amino acids 135-160 of VP1 of Foot-and-mouth disease virus (FMDV) serotype O1 Campos (O1C) was constructed (pSYCMV-FMDV). Western blot analysis confirmed accumulation of the heterologous protein in plants infiltrated with pSYCMV-FMDV. Viruses are obligate parasites which survive in living organisms. Many diagnostic methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay, reverse transcription-polymerase chain reaction, loop-mediated isothermal amplification and oligonucleotide chip, have been widely used for diagnosis of plant virus diseases. Recently, the new technology, including next-generation sequencing (NGS) and analysis pipeline, for discovery of novel/variant viruses from plant samples has been developed and used. In this study, a total of 234 plant samples, including herbaceous and woody plants showing viral disease-like symptoms, were collected and tested using the NGS-based diagnostic system through two separate experiments. By analyzing the metatranscriptome data obtained from the two experiments, more than 700 contigs related to plant viruses, which contain DNA or RNA virus-like sequences such as positive- or negative-sense ssRNA virus, dsRNA virus, circular ssDNA virus, and reverse-transcribing circular dsDNA virus, were obtained, and 182 contigs have been confirmed in the individual plant samples to date. As a result, 19 putative novel viruses from 17 plant species have been identified. In addition, many highly divergent isolates of known viruses were also identified as well as new viral species, and a great part of contigs had high sequence similarities with known plant viruses. The natural infections of most known viruses with highly divergent genomes or not were first detected in new hosts or new geographic location (Korea), and molecular characterizations of these viruses would be useful in terms of the epidemiology of pathogenic plant viruses. These results indicate that a great amount of unknown or variant plant viruses would exist in all kinds of plants and paired-end RNA sequencing could be a useful tool for the detection of all type of plant viruses.
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