유전자변형 옥수수의 개발과 상업적 이용이 증가하면서 유전자변형 옥수수 의심시료의 LMO 이벤트를 확인 할 수 있는 적합한 방법 개발이 필요하다. 국내에서는 상업적 재배와 자연생태계의 의도적 비의도적 LMO의 유출이 허용되고 있지 않다. 본 연구에서는 국내 승인된 11개의 LM 옥수수 이벤트를 동시에 검출할 수 있는 동시검출기법을 개발하였다. 이 방법은 시간과 비용, 노동력을 절감할 수 있는 효율적인 방법으로 4종의 PCR set로 개발하였다. 2012년부터 2014년까지 국립환경과학원 및 국립생태원에서 실시한 LMO 자연환경 모니터링 의심시료를 이용하여 동시검출기법의 효율성을 검증하였다. 이러한 결과를 바탕으로 본 연구의 결과는 LMO 모니터링 시료의 분석에 적합한 방법임을 알 수 있었다.
유전자변형 옥수수의 개발과 상업적 이용이 증가하면서 유전자변형 옥수수 의심시료의 LMO 이벤트를 확인 할 수 있는 적합한 방법 개발이 필요하다. 국내에서는 상업적 재배와 자연생태계의 의도적 비의도적 LMO의 유출이 허용되고 있지 않다. 본 연구에서는 국내 승인된 11개의 LM 옥수수 이벤트를 동시에 검출할 수 있는 동시검출기법을 개발하였다. 이 방법은 시간과 비용, 노동력을 절감할 수 있는 효율적인 방법으로 4종의 PCR set로 개발하였다. 2012년부터 2014년까지 국립환경과학원 및 국립생태원에서 실시한 LMO 자연환경 모니터링 의심시료를 이용하여 동시검출기법의 효율성을 검증하였다. 이러한 결과를 바탕으로 본 연구의 결과는 LMO 모니터링 시료의 분석에 적합한 방법임을 알 수 있었다.
With the increasing development and commercial use of genetically modified maize, it is essential to develop an appropriate method for detection of individual LMO (Living modified organism) events for monitoring the samples. In South Korea, commercial planting and accidental or unintentional release...
With the increasing development and commercial use of genetically modified maize, it is essential to develop an appropriate method for detection of individual LMO (Living modified organism) events for monitoring the samples. In South Korea, commercial planting and accidental or unintentional releases of LMOs into the environment were not approved. In this study, to increase the efficiency of LMO detection, we developed simultaneous detection methods for 11 LM maize events. This multiplex PCR detection method is economical, as it saves time, cost and labor. We developed 11 individual LM maize events, and applied 4 multiplex PCR sets to the LM maize samples. These results are confirmed by applying the multiplex analysis of LMO environmental monitoring from 2012 to 2014, which represents the unintentionally released LM maize samples. The data were correlated with event specific PCR results. Our results indicate that the multiplex PCR method developed is suitable for detection of LM maize in LMO monitoring.
With the increasing development and commercial use of genetically modified maize, it is essential to develop an appropriate method for detection of individual LMO (Living modified organism) events for monitoring the samples. In South Korea, commercial planting and accidental or unintentional releases of LMOs into the environment were not approved. In this study, to increase the efficiency of LMO detection, we developed simultaneous detection methods for 11 LM maize events. This multiplex PCR detection method is economical, as it saves time, cost and labor. We developed 11 individual LM maize events, and applied 4 multiplex PCR sets to the LM maize samples. These results are confirmed by applying the multiplex analysis of LMO environmental monitoring from 2012 to 2014, which represents the unintentionally released LM maize samples. The data were correlated with event specific PCR results. Our results indicate that the multiplex PCR method developed is suitable for detection of LM maize in LMO monitoring.
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문제 정의
국내에서는 상업적 재배와 자연생태계의 의도적·비의도적 LMO의 유출이 허용되고 있지 않다. 본 연구에서는 국내 승인된 11개의 LM 옥수수 이벤트를 동시에 검출할 수 있는 동시검출기법을 개발하였다. 이 방법은 시간과 비용, 노동력을 절감할 수 있는 효율적인 방법으로 4종의 PCR set로 개발하였다.
2013). 본 연구에서는 이러한 최신장비와 기술을 이용하여 분석하는 방법보다는 국내 연구실 환경에 맞춰 분자생물학 실험이 가능한 모든 연구실에서 LMO 분석 실험이 가능하도록 기존의 PCR법을 바탕으로 하여 검증의 효율성을 높이기 위한 Multiplex PCR 기법을 개발하고자 하였다. 또한 실제 모니터링에서 채집되는 다양한 형태의 옥수수 시료를 확립된 Multiplex PCR 법에 적용하여 얼마나 효율성이 있는지 확인하였다.
제안 방법
이 방법은 시간과 비용, 노동력을 절감할 수 있는 효율적인 방법으로 4종의 PCR set로 개발하였다. 2012년부터 2014년까지 국립환경과학원 및 국립생태원에서 실시한 LMO 자연환경 모니터링 의심시료를 이용하여 동시검출기법의 효율성을 검증하였다. 이러한 결과를 바탕으로 본 연구의 결과는 LMO 모니터링 시료의 분석에 적합한 방법임을 알 수 있었다.
2A lane 1, 2, 3; 2B lane 1, 2, 3; 2C lane 1, 2, 3; 2D lane 1, 2). 구축된 단일이벤트 검출결과를 바탕으로 혼합된 DNA 시료에서 Multiplex PCR 효율을 측정하기 위하여 30 ng/ul로 희석된 각각의 genomic DNA를 Set 별로 동일양 혼합 한 뒤 주형으로 사용하여 Multiplex PCR을 수행하였다(Fig. 2A lane 4, 2B lane 4, 2C lane 4, 2D lane 3).
국내 수입·승인된 LM 옥수수 단일이벤트 중 11개 이벤트에 대한 Multiplex PCR법을 확립하기 위해 primer 설계를 수행하였다. 유럽위원회 공동연구센터(Joint Research Centre-European Commission, JRC-EC)와 LM 환경위해성센터(Center for Environmental Risk Assessment, CERA)에 등록된 검출 primer를 바탕으로 각각의 이벤트 별로 증폭된 PCR products를 전기영동 하여 확인 한 후 PCR 증폭산물의 사이즈에 따라 Multiplex PCR에 사용 가능한 primer를 선별하였다(Table 1).
기존 검출 primer와 본 연구에서 새롭게 설계된 primer를 조합하여 11개 LM 시료에 대한 Multiplex PCR 기법을 개발하고자 4개의 Multiplex PCR Set (Set1: MON810, MIR162, DP098140; Set2: Bt176, Bt11, T25; Set3: 3272, GA21, NK603; Set4: MON89034, TC1507)을 설정하였다(Fig. 2).
본 연구를 통하여 구축한 Multiplex PCR 기법이 실제 국내 자연환경에 유출된 LM 옥수수 낙곡 및 자생체의 분석에도 적합한지 효율성을 검증하기 위해 2012년부터 2014년까지 LMO 모니터링을 통해 채집된 의심시료 중 11개 시료를 대상으로 추출한 genomic DNA를 주형으로 Multiplex PCR을 수행하였다(Fig. 3).
국내 수입·승인된 LM 옥수수 단일이벤트 중 11개 이벤트에 대한 Multiplex PCR법을 확립하기 위해 primer 설계를 수행하였다. 유럽위원회 공동연구센터(Joint Research Centre-European Commission, JRC-EC)와 LM 환경위해성센터(Center for Environmental Risk Assessment, CERA)에 등록된 검출 primer를 바탕으로 각각의 이벤트 별로 증폭된 PCR products를 전기영동 하여 확인 한 후 PCR 증폭산물의 사이즈에 따라 Multiplex PCR에 사용 가능한 primer를 선별하였다(Table 1). 사이즈 구별이 되지 않는 이벤트들은 각 이벤트 별 도입유전자 및 전사조절인자들의 유전자 구조와 옥수수의 게놈(Genome) 내 삽입된 주변 염기서열 분석을 위해 LMO 정보검색 사이트(http://en.
PCR 반응 조건은 95°C에서 5분간 변성 후, 95°C 15초, 60°C 20초간 40 cycle을 결합 및 신장 반응 시킨 뒤 4°C에서 PCR 반응을 중지시켰다. 증폭된 PCR 산물은 100bp DNA ladder (Solgent, Korea)와 함께 2.5% agarose gel 상에서 135 V로 전기영동 후 ChemiDoc TM XRS+ (Bio-Rad, USA)를 이용하여 전기영동 결과를 확인하였다. 동시검출을 위한 PCR 조건은 단일 이벤트 검출에서 증폭된 PCR Product 사이즈가 전기영동 상에서 구분되는지 확인 한 후 Multiplex PCR Set 별로 2~3쌍의 primer 농도로 조절하여 최적의 Multiplex PCR 조건을 확립하였다.
대상 데이터
DNA 형태인 T25 이벤트와 분말형태의 이벤트 표준물질(MON810, MIR162, DP098140, Bt176, Bt11, 3272, GA21, NK603, MON89034, TC1507)은 미국유지화학협회(American Oil Chemists’ Society, AOCS, USA)로부터 확보하였다. 또한 LM 옥수수 의심시료는 2012년부터 2014년까지 국립환경과학원 환경건강연구부 바이오안전연구팀 및 국립생태원 생태보전연구실에서 수행한 LMO 자연환경 모니터링 연구사업에서 확보한 LM 옥수수 낙곡 및 자생체(잎) 시료를 사용하였다.
DNA 형태인 T25 이벤트와 분말형태의 이벤트 표준물질(MON810, MIR162, DP098140, Bt176, Bt11, 3272, GA21, NK603, MON89034, TC1507)은 미국유지화학협회(American Oil Chemists’ Society, AOCS, USA)로부터 확보하였다. 또한 LM 옥수수 의심시료는 2012년부터 2014년까지 국립환경과학원 환경건강연구부 바이오안전연구팀 및 국립생태원 생태보전연구실에서 수행한 LMO 자연환경 모니터링 연구사업에서 확보한 LM 옥수수 낙곡 및 자생체(잎) 시료를 사용하였다. 표준물질과 LM 모니터링 의심시료의 genomic DNA는 DNeasy Plant mini Kit (Qiagen, German)를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 분리 및 정제하였다.
『유전자변형생물체 국가간 이동 등에 관한 법률』 제26조의 2에 따라 환경부는 국내 수입 유통과정 중 발생한 비의도적 LMO의 자연생태계 환경영향을 조사하기 위하여 매년 LMO 자연환경 모니터링을 수행 중이다. 본 연구에서 사용된 LM 의심시료는 2012년부터 2014년까지 국립환경과학원 및 국립생태원에서 수행한 모니터링 결과 LM 옥수수로 판정된 시료 중에 11개의 낙곡 및 자생체를 대상으로 하였다(Table 2). 순수 분리 정제한 낙곡 및 자생체(잎)의 genomic DNA를 주형으로 이용하여 기 확립된 Multiplex PCR의 효율성을 검증하였다.
유럽위원회 공동연구센터(Joint Research Centre-European Commission, JRC-EC)와 LM 환경위해성센터(Center for Environmental Risk Assessment, CERA)에 등록된 검출 primer를 바탕으로 각각의 이벤트 별로 증폭된 PCR products를 전기영동 하여 확인 한 후 PCR 증폭산물의 사이즈에 따라 Multiplex PCR에 사용 가능한 primer를 선별하였다(Table 1). 사이즈 구별이 되지 않는 이벤트들은 각 이벤트 별 도입유전자 및 전사조절인자들의 유전자 구조와 옥수수의 게놈(Genome) 내 삽입된 주변 염기서열 분석을 위해 LMO 정보검색 사이트(http://en.biosafetyscanner.org)를 이용하였다. 각 primer는 옥수수 게놈의 삽입 인근 부위와 각 이벤트의 삽입유전자 부위를 조합하여 특이적으로만 증폭 될 수 있도록 설계하였다(Fig.
이론/모형
본 연구에서는 이러한 최신장비와 기술을 이용하여 분석하는 방법보다는 국내 연구실 환경에 맞춰 분자생물학 실험이 가능한 모든 연구실에서 LMO 분석 실험이 가능하도록 기존의 PCR법을 바탕으로 하여 검증의 효율성을 높이기 위한 Multiplex PCR 기법을 개발하고자 하였다. 또한 실제 모니터링에서 채집되는 다양한 형태의 옥수수 시료를 확립된 Multiplex PCR 법에 적용하여 얼마나 효율성이 있는지 확인하였다.
성능/효과
3). 각각의 의심시료를 대상으로 실시한 Multiplex PCR 결과 확보한 11개의 LM 의심시료는 모두 수입이 승인된 LM 옥수수임을 확인할 수 있었다. Multiplex Set 3의 경우 표준물질을 주형으로 실시한 PCR에서 비교적 큰 사이즈에서 non-specific 밴드가 증폭되는 패턴을 보였는데 LM 옥수수를 대상으로 실시한 PCR에서도 동일한 non-specific 밴드가 관찰되었다(Fig.
Multiplex PCR법을 개발하기 위해서는 승인된 이벤트의 유전자 서열 확보는 물론 혼합된 시료에서 이벤트를 효율적으로 검증할 수 있는 Primer의 종류와 농도의 조절이 관건이라 하겠다. 그리고 확립된 검출기법은 실제 LMO 모니터링 시료에 적용함으로써 Multiplex PCR법의 효용성과 효율성을 확인할 수 있다. 본 연구를 통하여 현재 국내 수입 및 유통이 승인된 LM 옥수수 이벤트 중 11개 이벤트에 대한 동시검출 기법을 확립할 수 있었으며 실제 LMO 모니터링에서 채집된 다양한 형태의 시료들을 이용하여 Multiplex PCR의 효율성을 검증하였다.
그리고 확립된 검출기법은 실제 LMO 모니터링 시료에 적용함으로써 Multiplex PCR법의 효용성과 효율성을 확인할 수 있다. 본 연구를 통하여 현재 국내 수입 및 유통이 승인된 LM 옥수수 이벤트 중 11개 이벤트에 대한 동시검출 기법을 확립할 수 있었으며 실제 LMO 모니터링에서 채집된 다양한 형태의 시료들을 이용하여 Multiplex PCR의 효율성을 검증하였다. 매년 신규 이벤트가 새롭게 승인되는 국내 여건에서 지속적인 단일이벤트 검출기법과 Multiplex PCR법의 개발은 보다 효율적인 LMO 모니터링 사업의 수행을 위해 필수적이며 LMO 안전관리의 시작이라 할 수 있다.
2012년부터 2014년까지 국립환경과학원 및 국립생태원에서 실시한 LMO 자연환경 모니터링 의심시료를 이용하여 동시검출기법의 효율성을 검증하였다. 이러한 결과를 바탕으로 본 연구의 결과는 LMO 모니터링 시료의 분석에 적합한 방법임을 알 수 있었다.
2A lane 4, 2B lane 4, 2C lane 4, 2D lane 3). 전기 영동 하여 확인한 결과 유사한 증폭 효율을 보이는 Multiplex PCR 밴드를 육안으로 쉽게 구분할 수 있었다.
후속연구
3C). Multiplex Set 4는 11개의 의심시료에서는 포함되지 않는 이벤트로 확인하였으며 추후 추가적인 LM 의심시료 분석을 통해 효율성 검증이 필요할 것으로 사료된다(Fig. 3D).
실제로 본 연구의 결과 11개의 LMO 의심시료를 11개 단일이벤트 검출기법으로 검증하기 위해서는 121회의 PCR 반응이 필요하지만 확립된 4 Set의 Multiplex PCR을 활용하면 44회의 PCR 반응 만으로도 각각의 의심시료가 어떤 이벤트인지 분석이 가능하다. 따라서 자연생태계에 비의도적으로 유출된 LMO 시료를 과학적으로 분석하기 위해서 지속적인 단일이벤트 검출기법 개발과 Multiplex PCR 개발이 필요하다. Jo et al.
유전자변형 옥수수의 개발과 상업적 이용이 증가하면서 유전자변형 옥수수 의심시료의 LMO 이벤트를 확인 할 수 있는 적합한 방법 개발이 필요하다. 국내에서는 상업적 재배와 자연생태계의 의도적·비의도적 LMO의 유출이 허용되고 있지 않다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
LMO의 재배가 엄격히 규제되는 국가는 어디인가?
국내 LMO의 이용은 용도별 관계부처의 전문가 위해성심 사위원회에서 승인된 이벤트만을 수입 및 유통하고 있다. 유럽을 비롯한 우리나라에서는 일부 제한된 시험·연구용 재배를 제외하고 LMO의 재배가 엄격히 규제 되고 있어 수입되는 LMO의 유통과정에서 발생하는 자연생태계 비의도적 유출은 생물다양성의 위협요인으로 여겨지고 있다. 환경부와 국립생태원은 2009년부터 국내 사용중인 LMO의 자연생 태계 유출에 대한 모니터링을 수행 중이다.
ISAAA에 따르면 유전자변형(LM) 작물은 세계 전체 재배면적의 몇 %를 차지하는가?
생명공학기술이 현대 식량과 사료의 생산성 증대를 위해 인간의 생활에 적용된 이래 다양한 종류의 작물과 생물종이 개발 되고 있다. 국제생명공학응용정보서비스(International Service for the Acquisition of Agribiotech Application; ISAAA)의 2015년 발표자료에 따르면 유전자변형(LM) 작물은 전 세계적으로 179 백만 헥타르(ha)로 전체 재배면적 365 백만 헥타르 대비 49%를 차지하고 있다. LM 옥수수의 경우 전체 재배면적 185 백만 헥타르 대비 53.
유전자변형 옥수수의 재배면적은 전체 재배면적 대비 몇 퍼센트를 차지하는가?
국제생명공학응용정보서비스(International Service for the Acquisition of Agribiotech Application; ISAAA)의 2015년 발표자료에 따르면 유전자변형(LM) 작물은 전 세계적으로 179 백만 헥타르(ha)로 전체 재배면적 365 백만 헥타르 대비 49%를 차지하고 있다. LM 옥수수의 경우 전체 재배면적 185 백만 헥타르 대비 53.6 백만 헥타르로 29%를 차지한다. 국내 곡물자급률의 지속적인 감소는 수입 곡물양의 증가를 야기시켰으며 주요 곡물양의 대부분은 LM작물이 차지 하고 있다(KBCH 2015).
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