Chapter Ⅰ 벼에서 serotonin N-acetyltransferase 또는 N-acetylserotonin O-methyltransferase의 억제에 의한 멜라토닌 저생산은 산소결핍 상태에서는 자엽초의 성장을 향상시키고, 수확량 감소와 환경적 스트레스 감수성, 그리고 유묘의 성장지연을 야기한다.
Serotonin N-acetyltransferase (SNAT) 와 N-acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT)는 살아있는 유기체에서 멜라토닌 생합성을 위한 마지막 두 가지 핵심 효소들로 잘 알려져 있다. SNAT와 ASMT에 상응하는 유전자가 클로닝되었음에도 불구하고, 단백질의 세포 내 발현 위치와 효소적 특성은 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는, confocal microscopy를 이용하여, SNAT가 ...
Chapter Ⅰ 벼에서 serotonin N-acetyltransferase 또는 N-acetylserotonin O-methyltransferase의 억제에 의한 멜라토닌 저생산은 산소결핍 상태에서는 자엽초의 성장을 향상시키고, 수확량 감소와 환경적 스트레스 감수성, 그리고 유묘의 성장지연을 야기한다.
Serotonin N-acetyltransferase (SNAT) 와 N-acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT)는 살아있는 유기체에서 멜라토닌 생합성을 위한 마지막 두 가지 핵심 효소들로 잘 알려져 있다. SNAT와 ASMT에 상응하는 유전자가 클로닝되었음에도 불구하고, 단백질의 세포 내 발현 위치와 효소적 특성은 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는, confocal microscopy를 이용하여, SNAT가 엽록체에서 발현되는 것을 확인하였고, 반면에 ASMT는 세포질에서 발현된다는 것을 증명하였다. in vitro에서 ASMT 효소 활성은 뿌리에서 가장 높은 활성을 보였지만, SNAT는 어떠한 식물조직에서도 활성을 나타내지 않았다. 이 이유는 엽록체에서 발현되는 SNAT활성은 엽록체의 양이 증가할수록 저해되기 때문에 SNAT활성은 엽록체의 효과가 일정부분 관여한다고 보여진다. Cyanobacteria의 SNAT는 호열성이기 때문에 벼의 SNAT와 ASMT의 효소 활성에 대한 온도의 효과를 조사하였다. 정제된 재조합 벼의 SNAT와 ASMT 효소의 최고 활성을 나타내는 최적온도가 55 °C 라는 것을 확인하였고, 55 °C 에서 확인된 SNAT 단백질의 Km 과 Vmax 값은 270 µM과 3.3 nmol/min/mg protein인 반면에, ASMT의 Km 과 Vmax 값은 각각 222 µM과 9 nmol/min/mg protein였다. SNAT과 ASMT의 촉매효율성(Vmax/Km)은 식물체에서 30도 보다 55도에서 각각 16배, 4054배 더 높았고 이는 식물에서 멜라토닌의 함량은 고온에서 증가함을 시사한다. 추가적으로, 식물체 내에서 SNAT나 ASMT의 발현이 억제된 형질전환 벼에서 멜라토닌 생합성이 감소된 것을 확인하였고, SNAT과 ASMT 모두 멜라토닌 생합성에 기능적으로 연관되어 있다는 것을 증명하였다. 멜라토닌이 결핍된 SNAT 형질전환 벼는 유묘의 성장이 지체되는 표현형을 나타내었고, 멜라토닌을 처리함으로써 성장의 일부분이 회복되었는데 이는 유묘성장에 있어 멜라토닌이 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. 또한, wild-type과 비교했을 때 염분, 저온을 포함한 다양한 환경적 스트레스에 더욱 민감하게 반응하는 것을 확인하였다. 멜라토닌이 결핍된 SNAT 형질전환 벼는 anaerobic condition 조건과는 다르게 산소결핍조건(anoxic condition)에서 ADH유전자의 발현증가와 함께 자엽초의 성장이 증가되는 것을 확인하였다. 이것은 멜라토닌이 산소결핍 상태에서 식물의 성장을 역으로 조절한다는 것을 나타낸다. 이와 비슷하게, 멜라토닌이 결핍된 ASMT 형질전환 벼는 수확량이 감소되었을뿐만아니라 인위적으로 절단된 지엽에서의 노화가 빨라지는 표현형을 보여주었다. 이러한 멜라토닌 생합성 유전자의 loss of function 연구를 통해 멜라토닌이 식물의 성장을 촉진할 뿐만 아니라 다양한 환경적 스트레스들을 완화시켜준다는 기존의 pharmacological 연구결과를 확인하였다.
Chapter Ⅱ 벼에서 멜라토닌 생합성은 caffeic acid O-methyltransferase의 N-acetylserotonin O-methyltransferase 의 효소적 활성이 필요하다.
COMT는 N-acetylserotonin을 멜라토닌으로 전환하는 메틸화반응을 촉매한다. 즉, COMT는 N-acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT) 활성을 가지고 있으며, COMT의 ASMT 활성은 애기장대 COMT (AtCOMT)에서 처음으로 발견되었다. 다른 식물 종의 멜라토닌 생합성 과정에서 COMT의 연관성을 확인하기 위해, 벼 COMT (OsCOMT)의 ASMT 활성을 측정하였다. 대장균 배양을 통해 정제된 재조합 OsCOMT 단백질을 사용하여 OsCOMT의 매우 높은 ASMT 활성을 확인하였고, 이것은 AtCOMT의 ASMT와 비슷하였다. OsCOMT의 ASMT 활성에 대한 Km 과 Vmax 는 243 µM 과 2,400 pmol/min/mg protein였고, AtCOMT의 ASMT의 Km 과 Vmax 와 비슷했다. AtCOMT와 유사하게 OsCOMT는 세포질에 분포하고, In vitro에서 ASMT 활성은 농도 의존적으로 caffeic acid나 quercetin에 의해 매우 저해되었다. 이와 비슷하게, 4주된 벼의 절단된 잎에서 멜라토닌 함량은 quercetin에 의해 상당히 저해되었다. 끝으로, 벼 COMT 유전자가 과다발현된 형질전환 벼에서 멜라토닌 수치가 증가함을 확인하였고, 반대로 벼 COMT 유전자를 억제한 형질전환 벼에서의 멜라토닌 수치가 상당히 감소되는 것을 확인하였다. 이는 식물에서 멜라토닌 생합성에는 COMT가 직접적인 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.
식물에서 멜라토닌 생합성 유전자들이 클로닝되었음에도, 멜라토닌 이화작용 기작은 여전히 불분명한 채로 남아있다. 멜라토닌 물질대사에 관여하는 유전자들을 클로닝 하기 위해 벼의 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase (2-ODD)의 35개의 전장 (full-length) cDNA를 대장균에 발현시켰고, 이에 상응하는 재조합 단백질을 정제하였다. 4 개의 독립된 2-ODD 단백질은 멜라토닌을 2-hydroxymelatonin로 이화할 수 있다는 것을 In vitro assay 로 확인하였고, 이것은 melatonin 2-hydroxylase (M2H) 활성이 존재한다는 것을 시사한다. M2H 활성이 존재하는 4 개의 M2H 단백질들의 가장 높은 M2H 활성은 pH 8.0, 30°C 조건에서 가장 높게 나타났고, Km 의 범위는 121 µM에서 371 µM, Vmax의 범위는 1.7에서 18.5 pmol/min/mg protein임을 확인하였다. M2H 활성은 2-ODD 효소와 유사하게 α-ketoglutarate과 ascorbate, Fe2+과 같은 cofactor에 의존적이었다. M2H 활성은 2-ODD의 억제제인 prohexadione-Ca의 농도에 따라 저해되는 것이 확인되었다. M2H 활성은 벼 유묘의 뿌리에서 높게 나타났고, 2-ODD 21의 높은 전사레벨이 확인되는 것을 통해 2-ODD 21이 M2H 활성에 주요한 유전자임을 알 수 있었다. 멜라토닌을 처리한 벼 유묘의 뿌리에서 2-hydroxymelatonin이 높게 분석되었는데 이것은 뿌리에서 높게 발현된 M2H 활성과 밀접한 관계가 있다는 것이고, 이러한 결과들은 멜라토닌이 식물에서 M2H 유전자에 의해 2-hydroxymelatonin으로 대사된다는 것을 시사한다. 하지만 2-hydroxymelatonin의 생리학적 의미는 아직 밝혀지지 않았다. 그래서 식물에서 M2H 유전자의 기능을 밝히기 위해 먼저, cadmium (Cd)을 처리한 벼의 잎에서 멜라토닌 생합성과 분해에 관련된 유전자들의 발현 패턴과 M2H 유전자들의 세포 내 발현 위치 영역들을 조사하였다. Cd에 의해 유도된 멜라토닌 생합성은 tryptophan decarboxylase (TDC)와 tryptamine 5-hydroxylase (T5H), 그리고 N-acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT)을 포함한 멜라토닌 생합성 유전자들의 증가된 발현패턴과 일치했다. 그러나, 멜라토닌 생합성의 끝에서 두번째 유전자인 serotonin N-acetyltransferase (SNAT)의 발현은 하향조절 되었고, 이것은 멜라토닌 생합성이 SNAT에 의해 역조절된다는 것을 시사한다. 특히, 멜라토닌 생합성 유전자 발현의 유도는 멜라토닌 분해와 관련된 4개의 M2H 유전자들의 유도와 연동되어 멜라토닌 생합성과 분해를 위한 유전자가 대등하게 조절된다는 걸 시사한다. 유도된 M2H 유전자 발현은 증가된 M2H 효소 활성과 관련이 있었고, 3개의 M2H 단백질은 세포질, 나머지 1개 M2H 단백질은 엽록체에서 발현되는 것으로 확인되었는데, 이 결과는 멜라토닌 분해가 세포질과 엽록체에서 발생한다는 것을 의미한다. M2H 효소활성의 kinetic anslysis는 M2H의 촉매효율성은 serotonin N-acetyltransferase (SNAT)과 N-acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT)와 같은 다른 멜라토닌 생합성 효소들의 촉매효율성보다 더 높다는 것을 확인하였고, 이는 멜라토닌의 대사작용이 식물체내에서 빠르게 진행되는 것을 의미한다. 이 가설을 입증하기 위해 16 families에 속하는 24 종의 식물들을 선택하였고 liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)을 사용하여 멜라토닌과 2-hydroxymelatonin의 함량을 분석하였다. 대부분의 식물 종에서 멜라토닌 함량은 1 ng/g fresh weight (FW)보다 낮았고 반면에 열무와 화란국화는 각각 3.5ng, 3.3ng/g 이었다. 이와 대조적으로 나머지 식물 종에서 2-hydroxymelatonin 의 평균 함량은 6.2 ng/g FW보다 더 높았다. 식물에서 2-hydroxymelatonin의 함량과 멜라토닌 함량의 평균 비율은 대략 368:1로, 2-hydroxymelatonin 우위를 차지한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 in vivo에서의 멜라토닌 전환 결과뿐만 아니라 상응하는 효소들의 kinetic에 대한 이전의 결과들과 일치했다. 식물에서 여러 멜라토닌 metabolites 중에서, 가장 풍부한 metabolite는 2-hydroxymelatonin (99%)였고, 그 뒤를 이어 4-hydroxymelatonin (0.05%)였지만, 6-hydroxymelatonin은 벼의 유묘에서 발견되지 않았다.
Chapter Ⅰ 벼에서 serotonin N-acetyltransferase 또는 N-acetylserotonin O-methyltransferase의 억제에 의한 멜라토닌 저생산은 산소결핍 상태에서는 자엽초의 성장을 향상시키고, 수확량 감소와 환경적 스트레스 감수성, 그리고 유묘의 성장지연을 야기한다.
Serotonin N-acetyltransferase (SNAT) 와 N-acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT)는 살아있는 유기체에서 멜라토닌 생합성을 위한 마지막 두 가지 핵심 효소들로 잘 알려져 있다. SNAT와 ASMT에 상응하는 유전자가 클로닝되었음에도 불구하고, 단백질의 세포 내 발현 위치와 효소적 특성은 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는, confocal microscopy를 이용하여, SNAT가 엽록체에서 발현되는 것을 확인하였고, 반면에 ASMT는 세포질에서 발현된다는 것을 증명하였다. in vitro에서 ASMT 효소 활성은 뿌리에서 가장 높은 활성을 보였지만, SNAT는 어떠한 식물조직에서도 활성을 나타내지 않았다. 이 이유는 엽록체에서 발현되는 SNAT활성은 엽록체의 양이 증가할수록 저해되기 때문에 SNAT활성은 엽록체의 효과가 일정부분 관여한다고 보여진다. Cyanobacteria의 SNAT는 호열성이기 때문에 벼의 SNAT와 ASMT의 효소 활성에 대한 온도의 효과를 조사하였다. 정제된 재조합 벼의 SNAT와 ASMT 효소의 최고 활성을 나타내는 최적온도가 55 °C 라는 것을 확인하였고, 55 °C 에서 확인된 SNAT 단백질의 Km 과 Vmax 값은 270 µM과 3.3 nmol/min/mg protein인 반면에, ASMT의 Km 과 Vmax 값은 각각 222 µM과 9 nmol/min/mg protein였다. SNAT과 ASMT의 촉매효율성(Vmax/Km)은 식물체에서 30도 보다 55도에서 각각 16배, 4054배 더 높았고 이는 식물에서 멜라토닌의 함량은 고온에서 증가함을 시사한다. 추가적으로, 식물체 내에서 SNAT나 ASMT의 발현이 억제된 형질전환 벼에서 멜라토닌 생합성이 감소된 것을 확인하였고, SNAT과 ASMT 모두 멜라토닌 생합성에 기능적으로 연관되어 있다는 것을 증명하였다. 멜라토닌이 결핍된 SNAT 형질전환 벼는 유묘의 성장이 지체되는 표현형을 나타내었고, 멜라토닌을 처리함으로써 성장의 일부분이 회복되었는데 이는 유묘성장에 있어 멜라토닌이 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. 또한, wild-type과 비교했을 때 염분, 저온을 포함한 다양한 환경적 스트레스에 더욱 민감하게 반응하는 것을 확인하였다. 멜라토닌이 결핍된 SNAT 형질전환 벼는 anaerobic condition 조건과는 다르게 산소결핍조건(anoxic condition)에서 ADH유전자의 발현증가와 함께 자엽초의 성장이 증가되는 것을 확인하였다. 이것은 멜라토닌이 산소결핍 상태에서 식물의 성장을 역으로 조절한다는 것을 나타낸다. 이와 비슷하게, 멜라토닌이 결핍된 ASMT 형질전환 벼는 수확량이 감소되었을뿐만아니라 인위적으로 절단된 지엽에서의 노화가 빨라지는 표현형을 보여주었다. 이러한 멜라토닌 생합성 유전자의 loss of function 연구를 통해 멜라토닌이 식물의 성장을 촉진할 뿐만 아니라 다양한 환경적 스트레스들을 완화시켜준다는 기존의 pharmacological 연구결과를 확인하였다.
Chapter Ⅱ 벼에서 멜라토닌 생합성은 caffeic acid O-methyltransferase의 N-acetylserotonin O-methyltransferase 의 효소적 활성이 필요하다.
COMT는 N-acetylserotonin을 멜라토닌으로 전환하는 메틸화반응을 촉매한다. 즉, COMT는 N-acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT) 활성을 가지고 있으며, COMT의 ASMT 활성은 애기장대 COMT (AtCOMT)에서 처음으로 발견되었다. 다른 식물 종의 멜라토닌 생합성 과정에서 COMT의 연관성을 확인하기 위해, 벼 COMT (OsCOMT)의 ASMT 활성을 측정하였다. 대장균 배양을 통해 정제된 재조합 OsCOMT 단백질을 사용하여 OsCOMT의 매우 높은 ASMT 활성을 확인하였고, 이것은 AtCOMT의 ASMT와 비슷하였다. OsCOMT의 ASMT 활성에 대한 Km 과 Vmax 는 243 µM 과 2,400 pmol/min/mg protein였고, AtCOMT의 ASMT의 Km 과 Vmax 와 비슷했다. AtCOMT와 유사하게 OsCOMT는 세포질에 분포하고, In vitro에서 ASMT 활성은 농도 의존적으로 caffeic acid나 quercetin에 의해 매우 저해되었다. 이와 비슷하게, 4주된 벼의 절단된 잎에서 멜라토닌 함량은 quercetin에 의해 상당히 저해되었다. 끝으로, 벼 COMT 유전자가 과다발현된 형질전환 벼에서 멜라토닌 수치가 증가함을 확인하였고, 반대로 벼 COMT 유전자를 억제한 형질전환 벼에서의 멜라토닌 수치가 상당히 감소되는 것을 확인하였다. 이는 식물에서 멜라토닌 생합성에는 COMT가 직접적인 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.
식물에서 멜라토닌 생합성 유전자들이 클로닝되었음에도, 멜라토닌 이화작용 기작은 여전히 불분명한 채로 남아있다. 멜라토닌 물질대사에 관여하는 유전자들을 클로닝 하기 위해 벼의 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase (2-ODD)의 35개의 전장 (full-length) cDNA를 대장균에 발현시켰고, 이에 상응하는 재조합 단백질을 정제하였다. 4 개의 독립된 2-ODD 단백질은 멜라토닌을 2-hydroxymelatonin로 이화할 수 있다는 것을 In vitro assay 로 확인하였고, 이것은 melatonin 2-hydroxylase (M2H) 활성이 존재한다는 것을 시사한다. M2H 활성이 존재하는 4 개의 M2H 단백질들의 가장 높은 M2H 활성은 pH 8.0, 30°C 조건에서 가장 높게 나타났고, Km 의 범위는 121 µM에서 371 µM, Vmax의 범위는 1.7에서 18.5 pmol/min/mg protein임을 확인하였다. M2H 활성은 2-ODD 효소와 유사하게 α-ketoglutarate과 ascorbate, Fe2+과 같은 cofactor에 의존적이었다. M2H 활성은 2-ODD의 억제제인 prohexadione-Ca의 농도에 따라 저해되는 것이 확인되었다. M2H 활성은 벼 유묘의 뿌리에서 높게 나타났고, 2-ODD 21의 높은 전사레벨이 확인되는 것을 통해 2-ODD 21이 M2H 활성에 주요한 유전자임을 알 수 있었다. 멜라토닌을 처리한 벼 유묘의 뿌리에서 2-hydroxymelatonin이 높게 분석되었는데 이것은 뿌리에서 높게 발현된 M2H 활성과 밀접한 관계가 있다는 것이고, 이러한 결과들은 멜라토닌이 식물에서 M2H 유전자에 의해 2-hydroxymelatonin으로 대사된다는 것을 시사한다. 하지만 2-hydroxymelatonin의 생리학적 의미는 아직 밝혀지지 않았다. 그래서 식물에서 M2H 유전자의 기능을 밝히기 위해 먼저, cadmium (Cd)을 처리한 벼의 잎에서 멜라토닌 생합성과 분해에 관련된 유전자들의 발현 패턴과 M2H 유전자들의 세포 내 발현 위치 영역들을 조사하였다. Cd에 의해 유도된 멜라토닌 생합성은 tryptophan decarboxylase (TDC)와 tryptamine 5-hydroxylase (T5H), 그리고 N-acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT)을 포함한 멜라토닌 생합성 유전자들의 증가된 발현패턴과 일치했다. 그러나, 멜라토닌 생합성의 끝에서 두번째 유전자인 serotonin N-acetyltransferase (SNAT)의 발현은 하향조절 되었고, 이것은 멜라토닌 생합성이 SNAT에 의해 역조절된다는 것을 시사한다. 특히, 멜라토닌 생합성 유전자 발현의 유도는 멜라토닌 분해와 관련된 4개의 M2H 유전자들의 유도와 연동되어 멜라토닌 생합성과 분해를 위한 유전자가 대등하게 조절된다는 걸 시사한다. 유도된 M2H 유전자 발현은 증가된 M2H 효소 활성과 관련이 있었고, 3개의 M2H 단백질은 세포질, 나머지 1개 M2H 단백질은 엽록체에서 발현되는 것으로 확인되었는데, 이 결과는 멜라토닌 분해가 세포질과 엽록체에서 발생한다는 것을 의미한다. M2H 효소활성의 kinetic anslysis는 M2H의 촉매효율성은 serotonin N-acetyltransferase (SNAT)과 N-acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT)와 같은 다른 멜라토닌 생합성 효소들의 촉매효율성보다 더 높다는 것을 확인하였고, 이는 멜라토닌의 대사작용이 식물체내에서 빠르게 진행되는 것을 의미한다. 이 가설을 입증하기 위해 16 families에 속하는 24 종의 식물들을 선택하였고 liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)을 사용하여 멜라토닌과 2-hydroxymelatonin의 함량을 분석하였다. 대부분의 식물 종에서 멜라토닌 함량은 1 ng/g fresh weight (FW)보다 낮았고 반면에 열무와 화란국화는 각각 3.5ng, 3.3ng/g 이었다. 이와 대조적으로 나머지 식물 종에서 2-hydroxymelatonin 의 평균 함량은 6.2 ng/g FW보다 더 높았다. 식물에서 2-hydroxymelatonin의 함량과 멜라토닌 함량의 평균 비율은 대략 368:1로, 2-hydroxymelatonin 우위를 차지한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 in vivo에서의 멜라토닌 전환 결과뿐만 아니라 상응하는 효소들의 kinetic에 대한 이전의 결과들과 일치했다. 식물에서 여러 멜라토닌 metabolites 중에서, 가장 풍부한 metabolite는 2-hydroxymelatonin (99%)였고, 그 뒤를 이어 4-hydroxymelatonin (0.05%)였지만, 6-hydroxymelatonin은 벼의 유묘에서 발견되지 않았다.
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