고병원성 조류인플루엔자는 H5 그리고 H7 형 조류인플루엔자에 의한 바이러스성 질병이다. 고병원성조류인플루엔자는 경우에 따라 100% 폐사율을 보이기도 하며, 이는 가금 산업에 막대한 경제적 피해를 일으킨다. 일반적으로 고병원성 조류인플루엔자 발생을 통제하기 위해 차단 방역, 이동 제한, 살처분 조치를 취하고 있다. 그러나 이와 같은 차단 방역과 감염개체의 살처분에도 불구하고 질병의 전파를 막을 수 없는 경우에 가금류에 대한 백신으로 질병 발생을 통제 해왔다. 이와 함께 고병원성 조류인플루엔자 전파를 통제하기 위한 수단으로 비상 백신을 사전에 구축해놓는 것 또한 중요한 방역 수단의 하나이다. 본 연구의 주 목적은 닭과 오리에서 최근 유행하는 H5 형 고병원성 조류인플루엔자에 대한 방어 효능을 부여하는 백신을 개발하고 평가는 것이다. 본 논문 제 1장에서는 인플루엔자의 NA 단백질을 이용하여 백신개체로부터 야외주를 감별하는 백신을 제작하기 위해 자연계에 존재하는 H5와 NA 형의 조합을 조사하고, 가능한 NA 형을 선발하여 발현 백터에 삽입하였다. 최근 2010년과 2014년 발생했던 고병원성 조류인플루엔자 H5N1과 H5N8의 ...
고병원성 조류인플루엔자는 H5 그리고 H7 형 조류인플루엔자에 의한 바이러스성 질병이다. 고병원성조류인플루엔자는 경우에 따라 100% 폐사율을 보이기도 하며, 이는 가금 산업에 막대한 경제적 피해를 일으킨다. 일반적으로 고병원성 조류인플루엔자 발생을 통제하기 위해 차단 방역, 이동 제한, 살처분 조치를 취하고 있다. 그러나 이와 같은 차단 방역과 감염개체의 살처분에도 불구하고 질병의 전파를 막을 수 없는 경우에 가금류에 대한 백신으로 질병 발생을 통제 해왔다. 이와 함께 고병원성 조류인플루엔자 전파를 통제하기 위한 수단으로 비상 백신을 사전에 구축해놓는 것 또한 중요한 방역 수단의 하나이다. 본 연구의 주 목적은 닭과 오리에서 최근 유행하는 H5 형 고병원성 조류인플루엔자에 대한 방어 효능을 부여하는 백신을 개발하고 평가는 것이다. 본 논문 제 1장에서는 인플루엔자의 NA 단백질을 이용하여 백신개체로부터 야외주를 감별하는 백신을 제작하기 위해 자연계에 존재하는 H5와 NA 형의 조합을 조사하고, 가능한 NA 형을 선발하여 발현 백터에 삽입하였다. 최근 2010년과 2014년 발생했던 고병원성 조류인플루엔자 H5N1과 H5N8의 HA 유전자를 이용하여 두 개의 역유전학 유래 H5N9 인플루엔자를 고병원성 조류인플루엔자 백신 후보로 제작하였다. 이후, 특정 병원체 부재 계태아 종란 및 세포주에서 생성된 두 바이러스의 증식 특성을 조하였다. 또한 만일의 백신주 바이러스 노출에 대비하여 마우스와 닭에서 안전성을 평가하였다. 백신주로서 면역원성을 측정하기 위해 적혈구 응집억제 시험과 백혈구 증식 시험을 사용하여 닭에서 세포성, 체액성 면역반응을 평가하였다. 두 백신 주 바이러스의 계태아 종란에서 증식은 인체에서 이용되는 계절 독감 백신의 뼈대(backbone) 바이러스로 쓰이는 H1N1형 PR8 바이러스와 유사하였다. 마우스와 닭에서 병원성은 현재 저병원성 조류인플루엔자 백신 주로 사용되는 H9N2 바이러스와 동등하거나 낮은 수준이었다. 백신을 실시한 닭의 말초 림프구는 불활화 고병원성 조류인플루엔자 H5N1과 H5N8에 반응하였고, 혈청의 적혈구 응집억제 결과는 OIE의 고병원성 조류인플루엔자 백신 권장 역가를 충족하였다. 제 2장에서는 국내 야생조류에서 분리 한 H5N1, H5N8, H5N6 고병원성 조류인플루엔자에 대해 실제 방어 효능을 측정하였다. 또한, 두 백신의 다른 계통(clade) 바이러스에 대한 체액성 면역 반응을 측정하기 위해 동종 또는 이종의 항원을 이용한 적혈구 응집억제 반응을 닭과 오리에서 실시하였다. 두 백신은 동종 또는 이종의 H5N1, H5N8, H5N6 고병원성 조류인플루엔자 감염에 닭과 오리에서 모두 100% 생존 방어를 부여하였으며, 감염 바이러스의 배출을 측정 할 수 없는 수준으로 줄였다. 적혈구 응집억제 반응 결과 백신의 닭에서 면역원성 부여는 OIE 백신 권장 수준을 충족하였다. 그러나 먼 계통의 항원을 이용한 교차 적혈구 응집억제 반응 역가는 닭에서 방어 효능을 부여 할 수준에 다다르지 못하였다. 한편, 오리에서 적혈구 응집억제 반응 역가 결과는 OIE 백신 권장 수준을 충족하지 못하였다. 이는 오리에서 방어효능과 혈구 응집억제 역가 간의 상관관계에 대한 추가 연구가 필요할 것을 시사했다. 한편, 야외주 감염에 대한 마이크로 뉴라미니다아제 억제 시험으로 백신 후 감염 계군을 성공적으로 구별하여, 계군 수준의 감별을 실험실적으로 증명하였다. 제 3장에서는 오리에서 방어 가능한 면역 반응을 유도하면서도 체중 손실을 최소화하기 위한 백신 사용법을 찾기 위해 백신의 항원 용량, 어주번트 사용, 백신 주령을 조사하였다. 일 일령 오리에서 단회 백신은 적절한 면역반응을 유도하지 못하였다. 일 일령과 이 주령 오리에서 오일 어주번트를 이용한 H5N9 백신은 젤 어주번트를 이용한 H5N9 백신에 비해 도축 주령인 7주령에서 체중 손실을 일으켰다. 그러나 젤 어주번트를 이용한 백신은 적절한 면역반응을 일으키지 못하였고, 오일 어주번트를 이용한 추가 백신이 필요했다. 종합 해 볼 때 도축시기에 체중 손실 없이 면역 반응을 일으키는 백신 전략은 일 일령에 젤 어주번트를 이용하고 4주령에 오일 어주번트를 이용한 백신이었다. 또한 오리에서 백신 항원 용량을 낮추기 위해 CpG-ODN을 이용하였고, 중등도의 항원 용량을 이용을 이용하면서도 유의하게 적혈구 응집반응 억제 항체 역가를 상승시켰다. 결론적으로, 이 연구를 통해 최적화된 젤-오일 어주번트 전략, 최적의 항원 농도, CpG-ODN 첨가는 불활화 H5N9 고병원성 조류인플루엔자 백신의 야외적용 시험에서 면역반응 및 체중 증대 최대화에 중요한 정보가 될 것이다.
고병원성 조류인플루엔자는 H5 그리고 H7 형 조류인플루엔자에 의한 바이러스성 질병이다. 고병원성조류인플루엔자는 경우에 따라 100% 폐사율을 보이기도 하며, 이는 가금 산업에 막대한 경제적 피해를 일으킨다. 일반적으로 고병원성 조류인플루엔자 발생을 통제하기 위해 차단 방역, 이동 제한, 살처분 조치를 취하고 있다. 그러나 이와 같은 차단 방역과 감염개체의 살처분에도 불구하고 질병의 전파를 막을 수 없는 경우에 가금류에 대한 백신으로 질병 발생을 통제 해왔다. 이와 함께 고병원성 조류인플루엔자 전파를 통제하기 위한 수단으로 비상 백신을 사전에 구축해놓는 것 또한 중요한 방역 수단의 하나이다. 본 연구의 주 목적은 닭과 오리에서 최근 유행하는 H5 형 고병원성 조류인플루엔자에 대한 방어 효능을 부여하는 백신을 개발하고 평가는 것이다. 본 논문 제 1장에서는 인플루엔자의 NA 단백질을 이용하여 백신개체로부터 야외주를 감별하는 백신을 제작하기 위해 자연계에 존재하는 H5와 NA 형의 조합을 조사하고, 가능한 NA 형을 선발하여 발현 백터에 삽입하였다. 최근 2010년과 2014년 발생했던 고병원성 조류인플루엔자 H5N1과 H5N8의 HA 유전자를 이용하여 두 개의 역유전학 유래 H5N9 인플루엔자를 고병원성 조류인플루엔자 백신 후보로 제작하였다. 이후, 특정 병원체 부재 계태아 종란 및 세포주에서 생성된 두 바이러스의 증식 특성을 조하였다. 또한 만일의 백신주 바이러스 노출에 대비하여 마우스와 닭에서 안전성을 평가하였다. 백신주로서 면역원성을 측정하기 위해 적혈구 응집억제 시험과 백혈구 증식 시험을 사용하여 닭에서 세포성, 체액성 면역반응을 평가하였다. 두 백신 주 바이러스의 계태아 종란에서 증식은 인체에서 이용되는 계절 독감 백신의 뼈대(backbone) 바이러스로 쓰이는 H1N1형 PR8 바이러스와 유사하였다. 마우스와 닭에서 병원성은 현재 저병원성 조류인플루엔자 백신 주로 사용되는 H9N2 바이러스와 동등하거나 낮은 수준이었다. 백신을 실시한 닭의 말초 림프구는 불활화 고병원성 조류인플루엔자 H5N1과 H5N8에 반응하였고, 혈청의 적혈구 응집억제 결과는 OIE의 고병원성 조류인플루엔자 백신 권장 역가를 충족하였다. 제 2장에서는 국내 야생조류에서 분리 한 H5N1, H5N8, H5N6 고병원성 조류인플루엔자에 대해 실제 방어 효능을 측정하였다. 또한, 두 백신의 다른 계통(clade) 바이러스에 대한 체액성 면역 반응을 측정하기 위해 동종 또는 이종의 항원을 이용한 적혈구 응집억제 반응을 닭과 오리에서 실시하였다. 두 백신은 동종 또는 이종의 H5N1, H5N8, H5N6 고병원성 조류인플루엔자 감염에 닭과 오리에서 모두 100% 생존 방어를 부여하였으며, 감염 바이러스의 배출을 측정 할 수 없는 수준으로 줄였다. 적혈구 응집억제 반응 결과 백신의 닭에서 면역원성 부여는 OIE 백신 권장 수준을 충족하였다. 그러나 먼 계통의 항원을 이용한 교차 적혈구 응집억제 반응 역가는 닭에서 방어 효능을 부여 할 수준에 다다르지 못하였다. 한편, 오리에서 적혈구 응집억제 반응 역가 결과는 OIE 백신 권장 수준을 충족하지 못하였다. 이는 오리에서 방어효능과 혈구 응집억제 역가 간의 상관관계에 대한 추가 연구가 필요할 것을 시사했다. 한편, 야외주 감염에 대한 마이크로 뉴라미니다아제 억제 시험으로 백신 후 감염 계군을 성공적으로 구별하여, 계군 수준의 감별을 실험실적으로 증명하였다. 제 3장에서는 오리에서 방어 가능한 면역 반응을 유도하면서도 체중 손실을 최소화하기 위한 백신 사용법을 찾기 위해 백신의 항원 용량, 어주번트 사용, 백신 주령을 조사하였다. 일 일령 오리에서 단회 백신은 적절한 면역반응을 유도하지 못하였다. 일 일령과 이 주령 오리에서 오일 어주번트를 이용한 H5N9 백신은 젤 어주번트를 이용한 H5N9 백신에 비해 도축 주령인 7주령에서 체중 손실을 일으켰다. 그러나 젤 어주번트를 이용한 백신은 적절한 면역반응을 일으키지 못하였고, 오일 어주번트를 이용한 추가 백신이 필요했다. 종합 해 볼 때 도축시기에 체중 손실 없이 면역 반응을 일으키는 백신 전략은 일 일령에 젤 어주번트를 이용하고 4주령에 오일 어주번트를 이용한 백신이었다. 또한 오리에서 백신 항원 용량을 낮추기 위해 CpG-ODN을 이용하였고, 중등도의 항원 용량을 이용을 이용하면서도 유의하게 적혈구 응집반응 억제 항체 역가를 상승시켰다. 결론적으로, 이 연구를 통해 최적화된 젤-오일 어주번트 전략, 최적의 항원 농도, CpG-ODN 첨가는 불활화 H5N9 고병원성 조류인플루엔자 백신의 야외적용 시험에서 면역반응 및 체중 증대 최대화에 중요한 정보가 될 것이다.
Highly pathogenic avian influenza (HPAI) is a viral disease caused by H5 and H7 subtype avian influenza virus (AIV). HPAI causes great economic losses to poultry industry with almost 100% mortality and poses great challenges to public health. To control HPAI outbreak, several strategies have been ap...
Highly pathogenic avian influenza (HPAI) is a viral disease caused by H5 and H7 subtype avian influenza virus (AIV). HPAI causes great economic losses to poultry industry with almost 100% mortality and poses great challenges to public health. To control HPAI outbreak, several strategies have been applied including bio-security measures, movement control, and stamping-out. However, despite efforts to cull infected poultry and introduce biosecurity measures, when diseases are enzootic and/or bio-security measures are impractical to enforce, vaccination has become an important part of control programs for the HPAI enzootic countries. Together, preparing and stockpiling emergency vaccines to constrain and eliminate HPAI viruses is one of the important quarantine measures for the HPAI epizootic countries. Therefore, the major goal of this study is to develop and assess the HPAI vaccine which provide the chickens and ducks with protection against currently circulating H5 HPAI. In chapter 1, possible reassortment between H5 and NA subtype, which has existed by natural recombination, was searched and possible N9 subtypes were cloned for constructing expression vector in order to generate vaccine strains for differentiating infected from vaccinated animal (DIVA) using neuraminidase (NA) protein. Two reverse genetics-derived H5N9 subtype influenza virus were generated using hemagglutinin (HA) gene of H5N1 and H5N8 HPAI virus as a candidate of HPAI vaccine. Subsequently, the viral growth characteristics were measured in SPF-ECEs and cell lines. In case of possible contamination, the safety was evaluated using mice and chickens. The cellular and humoral immune responses in chickens were assessed using hemagglutination inhibition (HI) assay and lymphocyte proliferation assay. The viral growth properties of both two vaccine candidates were comparable to those of H1N1 subtype PR8 virus which has been used as a back-bone virus for human seasonal influenza vaccine due to its high growth in SPF-ECEs. The pathogenicity of two vaccine candidates in mice and chickens was equivalent to or lower than that of H9N2 LPAI vaccine strain currently in use. Peripheral lymphocytes of vaccinated chickens were reactive to stimuli of inactivated H5N1 and H5N8 HPAI antigen and mean serum HI titer fulfilled the OIE standard to an extent for alleviating viral shedding. In chapter 2, actual protective efficacy was determined against H5N1, H5N8, and H5N6 HPAI viruses isolated from wild birds during the migration seasons (2010, 2015, and 2016) in South Korea. In addition, heterologous HI tests were performed to estimate humoral immune responses against genetically distinct clade HPAI in both chickens and ducks. The vaccines conferred 100% survival protection against the homologous H5N1, H5N8, and H5N6 HPAI virus with significant viral shedding reduction to an undetectable level. The HI assay results indicated that the chickens was successfully immunized as recommended in OIE manual. However, heterologous HI titer against distinct clade HPAI did not reach to the protective level in chickens. Meanwhile, all the HI titer in ducks did not reach the OIE recommendation even against homologous antigen. This results suggested that further studies are needed to find correlation between HI titers with protective efficacy in ducks. The microneuraminidase inhibition test was successfully applied to differentiate the vaccinated-infected birds from vaccinated birds, suggesting that the test used in this study might comply with the DIVA strategy under flock basis concept. In chapter 3, antigen dose, adjuvant usage and timing of vaccination, which induce protective immune responses without body weight loss, were investigated to better understand the optimal usage of H5N9 vaccine in ducks. Single vaccination in day-old ducks was inadequate to induce protective HI titer even in the highest antigen dose. Meanwhile, oil-adjuvanted H5N9 vaccination in day-old and 2-week-old ducks decreased the body weight at the time of slaughtering compared to that of gel-adjuvanted H5N9 vaccine. On the contrary, gel-adjuvanted H5N9 vaccine failed to induce proper immune response, which required oil-adjuvanted boost vaccination. Taken together, the optimum vaccine strategy without body weight loss was prime vaccination with gel adjuvant and boost vaccination with oil adjuvant regimen. In addition, use of CpG-ODN could significantly increase HI antibody titer even in moderate antigen dose, which might save the antigen dose in practical use of H5N9 vaccine in domestic ducks. In conclusion, the gel prime-oil boost regimen, antigen dose and CpG-ODN supplement set in this study would be valuable information to maximize immune response and body weight gain in continuing the field application study.
Highly pathogenic avian influenza (HPAI) is a viral disease caused by H5 and H7 subtype avian influenza virus (AIV). HPAI causes great economic losses to poultry industry with almost 100% mortality and poses great challenges to public health. To control HPAI outbreak, several strategies have been applied including bio-security measures, movement control, and stamping-out. However, despite efforts to cull infected poultry and introduce biosecurity measures, when diseases are enzootic and/or bio-security measures are impractical to enforce, vaccination has become an important part of control programs for the HPAI enzootic countries. Together, preparing and stockpiling emergency vaccines to constrain and eliminate HPAI viruses is one of the important quarantine measures for the HPAI epizootic countries. Therefore, the major goal of this study is to develop and assess the HPAI vaccine which provide the chickens and ducks with protection against currently circulating H5 HPAI. In chapter 1, possible reassortment between H5 and NA subtype, which has existed by natural recombination, was searched and possible N9 subtypes were cloned for constructing expression vector in order to generate vaccine strains for differentiating infected from vaccinated animal (DIVA) using neuraminidase (NA) protein. Two reverse genetics-derived H5N9 subtype influenza virus were generated using hemagglutinin (HA) gene of H5N1 and H5N8 HPAI virus as a candidate of HPAI vaccine. Subsequently, the viral growth characteristics were measured in SPF-ECEs and cell lines. In case of possible contamination, the safety was evaluated using mice and chickens. The cellular and humoral immune responses in chickens were assessed using hemagglutination inhibition (HI) assay and lymphocyte proliferation assay. The viral growth properties of both two vaccine candidates were comparable to those of H1N1 subtype PR8 virus which has been used as a back-bone virus for human seasonal influenza vaccine due to its high growth in SPF-ECEs. The pathogenicity of two vaccine candidates in mice and chickens was equivalent to or lower than that of H9N2 LPAI vaccine strain currently in use. Peripheral lymphocytes of vaccinated chickens were reactive to stimuli of inactivated H5N1 and H5N8 HPAI antigen and mean serum HI titer fulfilled the OIE standard to an extent for alleviating viral shedding. In chapter 2, actual protective efficacy was determined against H5N1, H5N8, and H5N6 HPAI viruses isolated from wild birds during the migration seasons (2010, 2015, and 2016) in South Korea. In addition, heterologous HI tests were performed to estimate humoral immune responses against genetically distinct clade HPAI in both chickens and ducks. The vaccines conferred 100% survival protection against the homologous H5N1, H5N8, and H5N6 HPAI virus with significant viral shedding reduction to an undetectable level. The HI assay results indicated that the chickens was successfully immunized as recommended in OIE manual. However, heterologous HI titer against distinct clade HPAI did not reach to the protective level in chickens. Meanwhile, all the HI titer in ducks did not reach the OIE recommendation even against homologous antigen. This results suggested that further studies are needed to find correlation between HI titers with protective efficacy in ducks. The microneuraminidase inhibition test was successfully applied to differentiate the vaccinated-infected birds from vaccinated birds, suggesting that the test used in this study might comply with the DIVA strategy under flock basis concept. In chapter 3, antigen dose, adjuvant usage and timing of vaccination, which induce protective immune responses without body weight loss, were investigated to better understand the optimal usage of H5N9 vaccine in ducks. Single vaccination in day-old ducks was inadequate to induce protective HI titer even in the highest antigen dose. Meanwhile, oil-adjuvanted H5N9 vaccination in day-old and 2-week-old ducks decreased the body weight at the time of slaughtering compared to that of gel-adjuvanted H5N9 vaccine. On the contrary, gel-adjuvanted H5N9 vaccine failed to induce proper immune response, which required oil-adjuvanted boost vaccination. Taken together, the optimum vaccine strategy without body weight loss was prime vaccination with gel adjuvant and boost vaccination with oil adjuvant regimen. In addition, use of CpG-ODN could significantly increase HI antibody titer even in moderate antigen dose, which might save the antigen dose in practical use of H5N9 vaccine in domestic ducks. In conclusion, the gel prime-oil boost regimen, antigen dose and CpG-ODN supplement set in this study would be valuable information to maximize immune response and body weight gain in continuing the field application study.
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