RNAi를 이용하여 점박이응애의 생리기능을 knock down 시키기 위해 응애저항성 유전자인 COPA와 COPE를 이용하였으며 이 두 개의 유전자를 대표작물인 콩에 형질전환 하였고 이 유전자들은 서울대학교 이시혁 교수님께 분양받아 이용하였다. 그리고 anthocyanin 함량을 콩에서 증가 시키기위해서 PAP1, IbMYB1a 유전자를 동아대학교 허재복 교수님께 분양받아 이용하였다. COPA, COPE 유전자를 콩에 도입하기 위해 pPZP 백터에 construct하였고 PAP1 유전자는 종자 특이적 발현 벡터인 pCKLSL-conp 를 사용하였고 IbMYB1a 유전자는 과발현 벡터인 pB2GW7를 사용하였다. 형질전환 방법으로는 Agrobacterium mediated 방법을 통해 형질전환 하였고, 개선된 half seed 방법을 이용하여 콩형질전환 효율을 향상시켰다. 유전자 도입에 효율이 좋은 Agrobacterium 감염을 이용해 국내 품종인 광안(Kwangan)콩에 접종하였고, 유전자 각각 COPA 23개, COPE 18개, PAP1 17개, IbMYB1a 9개의 형질전환체를 생산하였다. 형질전환 된 식물체의 DNA 도입여부를 확인하기 위하여 형질전환체들의 잎을 ...
RNAi를 이용하여 점박이응애의 생리기능을 knock down 시키기 위해 응애저항성 유전자인 COPA와 COPE를 이용하였으며 이 두 개의 유전자를 대표작물인 콩에 형질전환 하였고 이 유전자들은 서울대학교 이시혁 교수님께 분양받아 이용하였다. 그리고 anthocyanin 함량을 콩에서 증가 시키기위해서 PAP1, IbMYB1a 유전자를 동아대학교 허재복 교수님께 분양받아 이용하였다. COPA, COPE 유전자를 콩에 도입하기 위해 pPZP 백터에 construct하였고 PAP1 유전자는 종자 특이적 발현 벡터인 pCKLSL-conp 를 사용하였고 IbMYB1a 유전자는 과발현 벡터인 pB2GW7를 사용하였다. 형질전환 방법으로는 Agrobacterium mediated 방법을 통해 형질전환 하였고, 개선된 half seed 방법을 이용하여 콩형질전환 효율을 향상시켰다. 유전자 도입에 효율이 좋은 Agrobacterium 감염을 이용해 국내 품종인 광안(Kwangan)콩에 접종하였고, 유전자 각각 COPA 23개, COPE 18개, PAP1 17개, IbMYB1a 9개의 형질전환체를 생산하였다. 형질전환 된 식물체의 DNA 도입여부를 확인하기 위하여 형질전환체들의 잎을 sampling 하여서 genomic DNA isolation 후 PCR을 분석을 통해 도입된 각각의 gene과 Bar gene, T DNA 도입을 확인 하였다. 또한, RNA를 추출하여 RT-PCR을 진행 하여 도입된 유전자와 Bar 유전자의 발현을 확인하였다. 콩 형질전환체에 도입된 유전자의 copy수를 확인하기 위해 T0, T1 식물체로의 잎을 sampling 하여 genomic DNA를 추출하고 southern blot을 수행하였다. COPA의 bar gene copy는 T1세대에서 6, 11, 17, 23 번 라인에서 1copy, 21번에서 multi copy를 확인하였다. COPE의 bar gene copy는 T0세대에서 3, 4, 5, 6, 8, 17번 라인에서 1copy를 확인했고 1, 2, 7, 9, 15번 라인에서 muti copy를 확인했다. PAP1의 경우 qRT-PCR을 통해 9, 12번에서 1copy를 확인할 수 있었고 10, 11, 15, 16번 라인에서 muti copy를 예상할 수 있었다. COPA, COPE 도입 형질전환체에 누적사충률과 hair pin RNA의 발현을 실험해본 결과 점박이 응애의 사충률은 낮았지만 점박이응애의 mortality에 영향이 있었음을 알 수 있었다. 실험 과정 중에 생긴 오류에 대해 분석중이고 COPE의 7번 라인은 hair pin RNA의 상대적 발현량이 높았기 때문에 다른 실험을 계획 중이다. PAP1 도입 형질전환체의 T1종자를 HPLC 실험한 결과 안토시아닌 함량이 종자에 없는 것으로 확인되어 결과는 첨부하지 않았다. IbMYB1a 도입 형질전환체의 잎 sample을 이용하여 안토시아닌 함량 분석 결과 안토시아닌이 축적된 것을 확인할 수 있었고 이 유전자를 종자특이적 발현 vector에 construct하여 형질전환을 진행 중이다.
RNAi를 이용하여 점박이응애의 생리기능을 knock down 시키기 위해 응애저항성 유전자인 COPA와 COPE를 이용하였으며 이 두 개의 유전자를 대표작물인 콩에 형질전환 하였고 이 유전자들은 서울대학교 이시혁 교수님께 분양받아 이용하였다. 그리고 anthocyanin 함량을 콩에서 증가 시키기위해서 PAP1, IbMYB1a 유전자를 동아대학교 허재복 교수님께 분양받아 이용하였다. COPA, COPE 유전자를 콩에 도입하기 위해 pPZP 백터에 construct하였고 PAP1 유전자는 종자 특이적 발현 벡터인 pCKLSL-conp 를 사용하였고 IbMYB1a 유전자는 과발현 벡터인 pB2GW7를 사용하였다. 형질전환 방법으로는 Agrobacterium mediated 방법을 통해 형질전환 하였고, 개선된 half seed 방법을 이용하여 콩형질전환 효율을 향상시켰다. 유전자 도입에 효율이 좋은 Agrobacterium 감염을 이용해 국내 품종인 광안(Kwangan)콩에 접종하였고, 유전자 각각 COPA 23개, COPE 18개, PAP1 17개, IbMYB1a 9개의 형질전환체를 생산하였다. 형질전환 된 식물체의 DNA 도입여부를 확인하기 위하여 형질전환체들의 잎을 sampling 하여서 genomic DNA isolation 후 PCR을 분석을 통해 도입된 각각의 gene과 Bar gene, T DNA 도입을 확인 하였다. 또한, RNA를 추출하여 RT-PCR을 진행 하여 도입된 유전자와 Bar 유전자의 발현을 확인하였다. 콩 형질전환체에 도입된 유전자의 copy수를 확인하기 위해 T0, T1 식물체로의 잎을 sampling 하여 genomic DNA를 추출하고 southern blot을 수행하였다. COPA의 bar gene copy는 T1세대에서 6, 11, 17, 23 번 라인에서 1copy, 21번에서 multi copy를 확인하였다. COPE의 bar gene copy는 T0세대에서 3, 4, 5, 6, 8, 17번 라인에서 1copy를 확인했고 1, 2, 7, 9, 15번 라인에서 muti copy를 확인했다. PAP1의 경우 qRT-PCR을 통해 9, 12번에서 1copy를 확인할 수 있었고 10, 11, 15, 16번 라인에서 muti copy를 예상할 수 있었다. COPA, COPE 도입 형질전환체에 누적사충률과 hair pin RNA의 발현을 실험해본 결과 점박이 응애의 사충률은 낮았지만 점박이응애의 mortality에 영향이 있었음을 알 수 있었다. 실험 과정 중에 생긴 오류에 대해 분석중이고 COPE의 7번 라인은 hair pin RNA의 상대적 발현량이 높았기 때문에 다른 실험을 계획 중이다. PAP1 도입 형질전환체의 T1종자를 HPLC 실험한 결과 안토시아닌 함량이 종자에 없는 것으로 확인되어 결과는 첨부하지 않았다. IbMYB1a 도입 형질전환체의 잎 sample을 이용하여 안토시아닌 함량 분석 결과 안토시아닌이 축적된 것을 확인할 수 있었고 이 유전자를 종자특이적 발현 vector에 construct하여 형질전환을 진행 중이다.
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