[학위논문]추간판 세포의 배양 조건에 의한 자가포식 관련 분자의 상향 조절과 수핵의 재생효과 Regeneration of nucleus pulposus with upregulation of autophagy-related molecules by intervertebral disc cells culture conditions원문보기
이혜림
(Konkuk University
Department of Veterinary Medicine
국내박사)
추간판(intervertebral discs, IVD)의 퇴행은 요통의 일반적인 원인이며, 퇴행성 과정은 추간판 내부의 NP에서 시작된다. 자가포식(autophagy)과 세포사멸(apoptosis)는 추간판 세포의 대사 항상성 유지에 중요하다. 세포예정사(programmed cell death, ...
추간판(intervertebral discs, IVD)의 퇴행은 요통의 일반적인 원인이며, 퇴행성 과정은 추간판 내부의 NP에서 시작된다. 자가포식(autophagy)과 세포사멸(apoptosis)는 추간판 세포의 대사 항상성 유지에 중요하다. 세포예정사(programmed cell death, PCD)는 IVD 퇴행에 중심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 자가포식(autophagy)과 노화 또한 여러 연령과 관련된 질병의 발달에 핵심 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 저자는 수핵(nucleus pulposus, NP) 세포와 섬유륜(annulus fibrosus, AF) 세포를 이용하여 5% CO2 (control condition; C-NP) 이나 5% O2 (hypoxic condition; H-NP)의 다른 배양 조건에서 기질 성분의 변화와 PCD의 조절을 평가했다. 수핵과 섬유륜 세포는 랫드의 요추 디스크로부터 분리하였고, 연골과 자가포식 및 세포사멸에 관련된 유전자의 발현을 분석하였다. 첫번째 연구에서는 수핵 세포를 이용하여 다른 배양 조건에서 수핵세포의 PCD 조절을 평가하였다. 샘플은 p5, p10, p15 및 p20에서 세포를 회수하여 제조하였다. 세포는 p20까지 3-MA(자가포식의 억제제)와 PD98059 (ERK1/2의 억제제)를 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어진다. 연골형성 인자, 자가포식 인자 및 세포 자멸 인자의 발현을 평가 하였다. C-NP보다 H-NP에서 aggrecan, HIF-1, SIRT1, LC3-II/LC3의 발현이 높게 나타났고, C-NP에서는 Bax 및 Caspase-3의 상향 조절에 의해 세포사멸이 나타났다. H-NP에서 (p-ERK)/ERK의 단백질 발현이 3-MA(자가포식의 억제제)를 처리하였을때 전체 실험 기간 동안 증가했다. 또한 Beclin-1과 LC3-II/LC3-I의 발현도 3-MA의 H-NP에서 더 높게 나타났다. MDC 와 TEM의 결과에서는 자가포식소체의 발생이 C-NP보다 H-NP에서 더 진행되었음을 보여 주었다. 첫번째 연구 결과에서는 자가포식 관련 분자의 상향 조절이 저산소 상태에 의한 세포 외 기질의 조절을 통해 NP 세포의 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 관찰되었다. 두번째 연구에서는, 인터루킨-1β (IL-1β) 에 의해 자극된 H-NP에 대한 히알루론산 2500 kDa (HA), 1 % 젤란검 (GG)의 효과를 평가했다. H-NP는 컨트롤그룹, 10㎍/ml IL-1β(IL), IL+HA 및 IL+GG의 4 그룹으로 나누었다. 세포를 채취하여 live/dead 분석, 실시간 중합효소연쇄반응 및 면역 블롯 분석을 사용하여 조사 하였다. 우리의 생체 내 연구에서, 10 주된 쥐는 컨트롤그룹, 손상그룹, HA, HA+H-NP, GG 및 GG+H-NP의 6개의 그룹으로 나누었다. 손상 후 7일째에 디스크에 중합체를 주입되었다. 랫트는 수술 후 6주째에 희생시키고 조직화학 및 면역조직학적 분석을 통해 평가되었다. Sox-9 과 II 형 콜라겐의 mRNA 발현은 컨트롤군과 비교하여 IL+HA와 IL+GG에서 더 높았다. LC3-II/LC3 비율은 다른 그룹에 비해 IL+HA에서 더 높았다. Type II collagen과 LC3-II/LC3-I 비의 단백질 발현은 컨트롤그룹과 비교하여 IL+HA에서 더 높았다. 생체 내 결과는 II 형 콜라겐의 발현이 높고 NP의 구조가 HA 및 HA+H-NP 그룹에서 잘 유지된다는 것을 보여 주었다. II 형 콜라겐, Beclin-1, LC3-II/LC3-I 비율의 조직 단백질 발현은 컨트롤그룹에 비해 HA+H-NP 그룹에서 더 높았다. 우리의 결과는 연골형성 및 자가포식 관련 분자의 상향 조절은 HA에 의한 NP 조직의 재생에 영향을 미친다는 것을 관찰된다. 본 연구의 결과는 최적 배양 조건이 NP의 저산소상태임을 보여 주었다. 또한, 히알루론산/H-NP 복합체는 연골 형성 및 자가포식 관련 분자의 상향 조절에 의해 NP 조직의 재생을 유도하였다. 결론적으로 본 연구 결과는 NP에 보다 적합한 미세 환경을 제공함으로써 NP 재생에 대한 HA의 잠재적 치료 효과에 대한 유용한 정보를 제공한다.
추간판(intervertebral discs, IVD)의 퇴행은 요통의 일반적인 원인이며, 퇴행성 과정은 추간판 내부의 NP에서 시작된다. 자가포식(autophagy)과 세포사멸(apoptosis)는 추간판 세포의 대사 항상성 유지에 중요하다. 세포예정사(programmed cell death, PCD)는 IVD 퇴행에 중심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 자가포식(autophagy)과 노화 또한 여러 연령과 관련된 질병의 발달에 핵심 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 저자는 수핵(nucleus pulposus, NP) 세포와 섬유륜(annulus fibrosus, AF) 세포를 이용하여 5% CO2 (control condition; C-NP) 이나 5% O2 (hypoxic condition; H-NP)의 다른 배양 조건에서 기질 성분의 변화와 PCD의 조절을 평가했다. 수핵과 섬유륜 세포는 랫드의 요추 디스크로부터 분리하였고, 연골과 자가포식 및 세포사멸에 관련된 유전자의 발현을 분석하였다. 첫번째 연구에서는 수핵 세포를 이용하여 다른 배양 조건에서 수핵세포의 PCD 조절을 평가하였다. 샘플은 p5, p10, p15 및 p20에서 세포를 회수하여 제조하였다. 세포는 p20까지 3-MA(자가포식의 억제제)와 PD98059 (ERK1/2의 억제제)를 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어진다. 연골형성 인자, 자가포식 인자 및 세포 자멸 인자의 발현을 평가 하였다. C-NP보다 H-NP에서 aggrecan, HIF-1, SIRT1, LC3-II/LC3의 발현이 높게 나타났고, C-NP에서는 Bax 및 Caspase-3의 상향 조절에 의해 세포사멸이 나타났다. H-NP에서 (p-ERK)/ERK의 단백질 발현이 3-MA(자가포식의 억제제)를 처리하였을때 전체 실험 기간 동안 증가했다. 또한 Beclin-1과 LC3-II/LC3-I의 발현도 3-MA의 H-NP에서 더 높게 나타났다. MDC 와 TEM의 결과에서는 자가포식소체의 발생이 C-NP보다 H-NP에서 더 진행되었음을 보여 주었다. 첫번째 연구 결과에서는 자가포식 관련 분자의 상향 조절이 저산소 상태에 의한 세포 외 기질의 조절을 통해 NP 세포의 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 관찰되었다. 두번째 연구에서는, 인터루킨-1β (IL-1β) 에 의해 자극된 H-NP에 대한 히알루론산 2500 kDa (HA), 1 % 젤란검 (GG)의 효과를 평가했다. H-NP는 컨트롤그룹, 10㎍/ml IL-1β(IL), IL+HA 및 IL+GG의 4 그룹으로 나누었다. 세포를 채취하여 live/dead 분석, 실시간 중합효소연쇄반응 및 면역 블롯 분석을 사용하여 조사 하였다. 우리의 생체 내 연구에서, 10 주된 쥐는 컨트롤그룹, 손상그룹, HA, HA+H-NP, GG 및 GG+H-NP의 6개의 그룹으로 나누었다. 손상 후 7일째에 디스크에 중합체를 주입되었다. 랫트는 수술 후 6주째에 희생시키고 조직화학 및 면역조직학적 분석을 통해 평가되었다. Sox-9 과 II 형 콜라겐의 mRNA 발현은 컨트롤군과 비교하여 IL+HA와 IL+GG에서 더 높았다. LC3-II/LC3 비율은 다른 그룹에 비해 IL+HA에서 더 높았다. Type II collagen과 LC3-II/LC3-I 비의 단백질 발현은 컨트롤그룹과 비교하여 IL+HA에서 더 높았다. 생체 내 결과는 II 형 콜라겐의 발현이 높고 NP의 구조가 HA 및 HA+H-NP 그룹에서 잘 유지된다는 것을 보여 주었다. II 형 콜라겐, Beclin-1, LC3-II/LC3-I 비율의 조직 단백질 발현은 컨트롤그룹에 비해 HA+H-NP 그룹에서 더 높았다. 우리의 결과는 연골형성 및 자가포식 관련 분자의 상향 조절은 HA에 의한 NP 조직의 재생에 영향을 미친다는 것을 관찰된다. 본 연구의 결과는 최적 배양 조건이 NP의 저산소상태임을 보여 주었다. 또한, 히알루론산/H-NP 복합체는 연골 형성 및 자가포식 관련 분자의 상향 조절에 의해 NP 조직의 재생을 유도하였다. 결론적으로 본 연구 결과는 NP에 보다 적합한 미세 환경을 제공함으로써 NP 재생에 대한 HA의 잠재적 치료 효과에 대한 유용한 정보를 제공한다.
Degeneration of intervertebral discs (IVDs) is a common cause of lower back pain and, the degenerative process begins from NP in the inner part of the IVD. Autophagy and apoptosis are important for maintaining metabolic homeostasis in IVD cells. The author evaluated the expression and significance o...
Degeneration of intervertebral discs (IVDs) is a common cause of lower back pain and, the degenerative process begins from NP in the inner part of the IVD. Autophagy and apoptosis are important for maintaining metabolic homeostasis in IVD cells. The author evaluated the expression and significance of autophagy and apoptosis-related marker genes during long term cultures under different oxygen concentration, 5% CO2 (control condition; C-NP) or 5% O2 (hypoxic condition; H-NP) in nucleus pulposus (NP) cells. In addition, the author investigated the regenerative potency of hydrogels (hyaluronic acid or gellan gum)/H-NP composite in the repair of IVD degeneration using a rat model. In the first study, the NP cells were isolated from the lumbar discs of rats. The cells were treated with/without 3-MA (an inhibitor of autophagy), PD98059 (an inhibitor of ERK1/2) throughout the entire experimental period until passage 20 (p20). Samples were prepared at p5, p10, p15, and p20. The expressions of chondrogenic, autophagic, and apoptotic markers were evaluated. The author results the mRNA expression of aggrecan and LC3-II/LC3 ratio were higher in cells cultured under H-NP than C-NP. C-NP underwent apoptosis due to upregulation of Bax and Caspase-3. Protein expression of H-NP, phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK)/ERK ratio level was increased throughout the entire experimental period, with 3-MA (an inhibitor of autophagy). Also, the Beclin-1 and LC3-II/LC3-I ratio were higher in H-NP with 3-MA. MDC staining and TEM revealed that the development of the autophagosomes had progressed further in H-NP than in C-NP. These results indicate that the autophagy inhibit apoptosis in hypoxic condition of NP. In the second study, the author evaluated the effects of hyaluronic acid 2500 kDa (HA), 1% gellan gum (GG), on interleukin-1β (IL-1β) stimulated H-NP. The H-NP were divided into four groups: Con, 10 μg/ml IL-1β (IL), IL+HA, and IL+GG. The cells were collected and examined using live/dead assay, real-time PCR and immunoblot analysis. In vivo study, 10-weeks-old rats were divided into six groups: Con, injury, HA, HA+H-NP, GG and GG+H-NP. In 7 days after injury, the natural polymers were injected into induced disc degeneration. The Rats were killed at 6-weeks postoperatively and evaluated via the histochemical and immunohistological analyses. The hydrogels/H-NP composite results, the mRNA expression of Sox-9 and type II collagen was higher in IL+HA and IL+GG compared with Con. The LC3-II/LC3 ratio level was higher in the IL+HA than in other groups. The protein expression of type II collagen and LC3-II/LC3-I ratio were higher in the IL+HA compared with in the Con. In vivo results showed that the expression of type II collagen was higher and the structure of the NP was well maintained in the HA and HA+H-NP groups. The tissue protein expression of type II collagen, Beclin-1 and LC3-II/LC3-I ratio levels were higher in the HA+H-NP group compared with the Con group. The author results suggest that up-regulation of chondrogenic and autophagy-related molecules is influences the regeneration of NP tissues by HA. The author results revealed that the optimal culture conditions of NP are hypoxic condition. Also, the hyaluronic acid/H-NP composite was induced the regeneration of NP tissues by up-regulation of chondrogenic and autophagy-related molecules. Conclusively, the author study results provide useful information on the potential therapeutic effect of HA for NP regeneration as it provides a microenvironment that is more suitable for NP.
Degeneration of intervertebral discs (IVDs) is a common cause of lower back pain and, the degenerative process begins from NP in the inner part of the IVD. Autophagy and apoptosis are important for maintaining metabolic homeostasis in IVD cells. The author evaluated the expression and significance of autophagy and apoptosis-related marker genes during long term cultures under different oxygen concentration, 5% CO2 (control condition; C-NP) or 5% O2 (hypoxic condition; H-NP) in nucleus pulposus (NP) cells. In addition, the author investigated the regenerative potency of hydrogels (hyaluronic acid or gellan gum)/H-NP composite in the repair of IVD degeneration using a rat model. In the first study, the NP cells were isolated from the lumbar discs of rats. The cells were treated with/without 3-MA (an inhibitor of autophagy), PD98059 (an inhibitor of ERK1/2) throughout the entire experimental period until passage 20 (p20). Samples were prepared at p5, p10, p15, and p20. The expressions of chondrogenic, autophagic, and apoptotic markers were evaluated. The author results the mRNA expression of aggrecan and LC3-II/LC3 ratio were higher in cells cultured under H-NP than C-NP. C-NP underwent apoptosis due to upregulation of Bax and Caspase-3. Protein expression of H-NP, phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (p-ERK)/ERK ratio level was increased throughout the entire experimental period, with 3-MA (an inhibitor of autophagy). Also, the Beclin-1 and LC3-II/LC3-I ratio were higher in H-NP with 3-MA. MDC staining and TEM revealed that the development of the autophagosomes had progressed further in H-NP than in C-NP. These results indicate that the autophagy inhibit apoptosis in hypoxic condition of NP. In the second study, the author evaluated the effects of hyaluronic acid 2500 kDa (HA), 1% gellan gum (GG), on interleukin-1β (IL-1β) stimulated H-NP. The H-NP were divided into four groups: Con, 10 μg/ml IL-1β (IL), IL+HA, and IL+GG. The cells were collected and examined using live/dead assay, real-time PCR and immunoblot analysis. In vivo study, 10-weeks-old rats were divided into six groups: Con, injury, HA, HA+H-NP, GG and GG+H-NP. In 7 days after injury, the natural polymers were injected into induced disc degeneration. The Rats were killed at 6-weeks postoperatively and evaluated via the histochemical and immunohistological analyses. The hydrogels/H-NP composite results, the mRNA expression of Sox-9 and type II collagen was higher in IL+HA and IL+GG compared with Con. The LC3-II/LC3 ratio level was higher in the IL+HA than in other groups. The protein expression of type II collagen and LC3-II/LC3-I ratio were higher in the IL+HA compared with in the Con. In vivo results showed that the expression of type II collagen was higher and the structure of the NP was well maintained in the HA and HA+H-NP groups. The tissue protein expression of type II collagen, Beclin-1 and LC3-II/LC3-I ratio levels were higher in the HA+H-NP group compared with the Con group. The author results suggest that up-regulation of chondrogenic and autophagy-related molecules is influences the regeneration of NP tissues by HA. The author results revealed that the optimal culture conditions of NP are hypoxic condition. Also, the hyaluronic acid/H-NP composite was induced the regeneration of NP tissues by up-regulation of chondrogenic and autophagy-related molecules. Conclusively, the author study results provide useful information on the potential therapeutic effect of HA for NP regeneration as it provides a microenvironment that is more suitable for NP.
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