[학위논문]PM Aperture를 이용한 Radial 편광 된 여기빔을 이용한 CW STED 현미경의 성능향상 Enhancement of CW STED Microscopy with Radially Polarized Excitation Beam using PM Aperture원문보기
이 연구에서는, Radial polarized 된 Excitation beam을 Phase modulation 시켜 Continuous Wave (CW) STED microscopy 의 lateral resolution 향상에 대해서 연구했다. Radial polarized 된 Excitation beam을 특수 제작한 Phase aperture에 통과시켜 spot size가 줄어드는 것을 확인했다. 이 감소된 Excitation beam은 STED microscopy 에서도 끼치는 효과가 크다. 이를 확인하기 위해 ...
이 연구에서는, Radial polarized 된 Excitation beam을 Phase modulation 시켜 Continuous Wave (CW) STED microscopy 의 lateral resolution 향상에 대해서 연구했다. Radial polarized 된 Excitation beam을 특수 제작한 Phase aperture에 통과시켜 spot size가 줄어드는 것을 확인했다. 이 감소된 Excitation beam은 STED microscopy 에서도 끼치는 효과가 크다. 이를 확인하기 위해 시뮬레이션과 실험을 진행하였다. 이 연구에서 사용 된 시뮬레이션은 초점에서의 필드 분포가 빔 입력 조건에 의해 확인 될 수 있는 벡터회절 이론을 기반으로 한다. Radial polarized 된 excitation beam을 Amplitude modulation와 phase modulation의 PSF 분포를 비교 분석하였다. 또한 Depletion beam에 관련된 term을 추가하여 STED 효과가 가 더 효과적으로 일어나는 것을 확인했다. Simulation 결과 amplitude modulation 대비 Phase modulation의 excitation beam의 빔스팟 크기가 대략 20% 향상됨을 확인하였다. 후자의 경우에 sidelobe가 다소 발생함을 보였지만 이는 Depletion beam을 통해서 효과적으로 억누르는 것이 가능함을 확인했다. 결과적으로 CW STED 현미경의 해상도 증가를 가능케 했다. 실험 방법은 2 Path로 구성하여 excitation beam path 중 같은 위치에Amplitude aperture와 Phase aperture를 교체해가며 실험을 진행했다. 추가적으로 일반적인 STED의 경우도 비교를 하였다. 실험에 사용된 두 aperture 는 모두 quartz로 만들어졌으며 Amplitude modulation은 chrome masking으로 일정비율 beam을 block하고, phase modulation에선 527nm로 두께 차이를 두어 반 파장을 delay시켰다. 실험은Fluorescence bead와 Bio sample을 imaging하는 것으로 진행했다. 우선 Fluorescence bead로 전반적인 해상도 향상과 STED 효과를 확인하였다. 그 결과 제안된 방법이 기존 Amplitude modulation과 비슷하고 기존 STED 대비 대략30% 향상된 결과를 보임을 확인했다. Phase aperture는 quartz를 lithography 공정을 거쳐 (조금 더 자세히 작성) 제작을 했다. Delay part와 아닌 부분의 경계가 많을수록 해상도 향상이 dominant 함을 확인하고 Phase delay를 주기 위해 etching 된 부분과 아닌 부분을 d=λΔϕ/2π(n-1)로 계산하여 527nm 차이를 두고 설계 했다. 이를 링 타입으로 설계했다. 우선 전반적인 실현 가능성을 확인하기 위하여 phase delay의 개수를 1개서부터 3개까지 만들어서 시뮬레이션과 실험을 진행하였다. 이를 각각 pattern 1~3 으로 명명 하였다. 회절에 대비하여 4f system을 적용시켜서 그것을 완화시켰다. 시뮬레이션 결과를 분석한 결과 pattern1 에서의 confocal은 166nm 해상도의 결과를 보였다. 이는 기존 confocal (186nm) 대비 20nm정도 향상된 모습을 보였다. 이는 STED 효율을 매우 증가시켰다. 실험에서도 다만 pattern2 부터 xz plane에서 초점면이 길어지고 갈라지는 경향이 있었다. 이는 시뮬레이션 결과와 괴리감이 있는 실험결과를 초래했다. 가장 효과가 극명하게 보이는 pattern1위주로 실험을 진행하였으며 STED power별로 데이터를 얻었다. Exponential한 곡선을 확인하였다. Conventional STED 대비 STED효율, 즉, 해상도가 높음을 확인하였다. 이런 결과들을 바탕으로 이것을 RPP- CW STED라고 명명했고 그것의 원말은 Radial polarization phase 이다. 본 연구는 기존 CW STED가 가지고 있는 해상도를 radial 편광과 phase plate를 사용하여 넘어섰다는 거에 큰 시사점이 있다. 이 연구를 바탕으로 더 발전된 STED현미경를 개발할 수 있기를 희망하는 바이다.
이 연구에서는, Radial polarized 된 Excitation beam을 Phase modulation 시켜 Continuous Wave (CW) STED microscopy 의 lateral resolution 향상에 대해서 연구했다. Radial polarized 된 Excitation beam을 특수 제작한 Phase aperture에 통과시켜 spot size가 줄어드는 것을 확인했다. 이 감소된 Excitation beam은 STED microscopy 에서도 끼치는 효과가 크다. 이를 확인하기 위해 시뮬레이션과 실험을 진행하였다. 이 연구에서 사용 된 시뮬레이션은 초점에서의 필드 분포가 빔 입력 조건에 의해 확인 될 수 있는 벡터 회절 이론을 기반으로 한다. Radial polarized 된 excitation beam을 Amplitude modulation와 phase modulation의 PSF 분포를 비교 분석하였다. 또한 Depletion beam에 관련된 term을 추가하여 STED 효과가 가 더 효과적으로 일어나는 것을 확인했다. Simulation 결과 amplitude modulation 대비 Phase modulation의 excitation beam의 빔스팟 크기가 대략 20% 향상됨을 확인하였다. 후자의 경우에 sidelobe가 다소 발생함을 보였지만 이는 Depletion beam을 통해서 효과적으로 억누르는 것이 가능함을 확인했다. 결과적으로 CW STED 현미경의 해상도 증가를 가능케 했다. 실험 방법은 2 Path로 구성하여 excitation beam path 중 같은 위치에Amplitude aperture와 Phase aperture를 교체해가며 실험을 진행했다. 추가적으로 일반적인 STED의 경우도 비교를 하였다. 실험에 사용된 두 aperture 는 모두 quartz로 만들어졌으며 Amplitude modulation은 chrome masking으로 일정비율 beam을 block하고, phase modulation에선 527nm로 두께 차이를 두어 반 파장을 delay시켰다. 실험은Fluorescence bead와 Bio sample을 imaging하는 것으로 진행했다. 우선 Fluorescence bead로 전반적인 해상도 향상과 STED 효과를 확인하였다. 그 결과 제안된 방법이 기존 Amplitude modulation과 비슷하고 기존 STED 대비 대략30% 향상된 결과를 보임을 확인했다. Phase aperture는 quartz를 lithography 공정을 거쳐 (조금 더 자세히 작성) 제작을 했다. Delay part와 아닌 부분의 경계가 많을수록 해상도 향상이 dominant 함을 확인하고 Phase delay를 주기 위해 etching 된 부분과 아닌 부분을 d=λΔϕ/2π(n-1)로 계산하여 527nm 차이를 두고 설계 했다. 이를 링 타입으로 설계했다. 우선 전반적인 실현 가능성을 확인하기 위하여 phase delay의 개수를 1개서부터 3개까지 만들어서 시뮬레이션과 실험을 진행하였다. 이를 각각 pattern 1~3 으로 명명 하였다. 회절에 대비하여 4f system을 적용시켜서 그것을 완화시켰다. 시뮬레이션 결과를 분석한 결과 pattern1 에서의 confocal은 166nm 해상도의 결과를 보였다. 이는 기존 confocal (186nm) 대비 20nm정도 향상된 모습을 보였다. 이는 STED 효율을 매우 증가시켰다. 실험에서도 다만 pattern2 부터 xz plane에서 초점면이 길어지고 갈라지는 경향이 있었다. 이는 시뮬레이션 결과와 괴리감이 있는 실험결과를 초래했다. 가장 효과가 극명하게 보이는 pattern1위주로 실험을 진행하였으며 STED power별로 데이터를 얻었다. Exponential한 곡선을 확인하였다. Conventional STED 대비 STED효율, 즉, 해상도가 높음을 확인하였다. 이런 결과들을 바탕으로 이것을 RPP- CW STED라고 명명했고 그것의 원말은 Radial polarization phase 이다. 본 연구는 기존 CW STED가 가지고 있는 해상도를 radial 편광과 phase plate를 사용하여 넘어섰다는 거에 큰 시사점이 있다. 이 연구를 바탕으로 더 발전된 STED현미경를 개발할 수 있기를 희망하는 바이다.
In this study, we have studied the lateral resolution enhancement of Continuous Wave (CW) STED microscopy by phase modulating a radial polarized excitation beam. The radial polarized excitation beam was passed through a specially designed phase aperture to confirm that the spot size was reduced. Thi...
In this study, we have studied the lateral resolution enhancement of Continuous Wave (CW) STED microscopy by phase modulating a radial polarized excitation beam. The radial polarized excitation beam was passed through a specially designed phase aperture to confirm that the spot size was reduced. This reduced excitation beam has a large effect on STED microscopy. Simulations and experiments were conducted to confirm this. The simulations used in this study are based on vector diffraction theory where the field distribution at the focus can be confirmed by beam input conditions. The radial polarized excitation beam was compared with PSF distribution of amplitude modulation and phase modulation. We also confirmed that the STED effect is more effective by adding the term related to the depletion beam. Simulation results show that the beam spot size of the excitation beam of phase modulation is about 20% higher than that of amplitude modulation. In the latter case, the sidelobe appeared to be somewhat evident, but it was confirmed that it was possible to suppress effectively through the depletion beam. As a result, the resolution of the CW STED microscope was increased. Experimental method was composed of 2 paths and experiment was performed by replacing the amplitude aperture and the phase aperture at the same position in the excitation beam path. In addition, general STED cases were also compared. Both apertures used in the experiments were made of quartz. Amplitude modulation was blocked by chrome masking at a certain rate, and phase modulation delayed the half wavelength with a thickness of 527 nm. The experiment proceeded to imaging Fluorescence bead and Bio sample. First, we confirmed the overall resolution improvement and the STED effect with the fluorescence bead. As a result, it was confirmed that the proposed method is similar to the conventional amplitude modulation and shows about 30% improvement compared to the conventional STED. The phase aperture was fabricated by lithography (a little more detail) than the quartz. The difference between the part and the non-part of the delay part was determined to be 527nm by calculating d = λΔφ / 2π (n-1) for the part of the etched part and the part for the phase delay. It was designed as a ring type. First, to verify the overall feasibility, simulation and experiment were conducted by making the number of phase delay from one to three. They were named pattern 1 ~ 3 respectively. The 4f system was applied to mitigate the diffraction. Analysis of the simulation results showed that confocal at pattern 1 had a resolution of 166 nm. It showed 20nm improvement compared to existing confocal (186nm). This greatly increased STED efficiency. In the experiment, however, the focal plane was longer and tended to split in the xz plane from pattern2. This resulted in experimental results with a sense of distance from the simulation results. Experiments were carried out on pattern1, which showed the best effect, and data were obtained for each STED power. Exponential curve was confirmed. STED efficiency compared to conventional STED, that is, resolution was high. Based on these results, we named it RPP-CW STED and its origin is Radial polarization phase. This study suggests that the resolution of existing CW STED is overcome by using radial polarization and phase plate. Based on this research, I hope to develop a more advanced STED microscope
In this study, we have studied the lateral resolution enhancement of Continuous Wave (CW) STED microscopy by phase modulating a radial polarized excitation beam. The radial polarized excitation beam was passed through a specially designed phase aperture to confirm that the spot size was reduced. This reduced excitation beam has a large effect on STED microscopy. Simulations and experiments were conducted to confirm this. The simulations used in this study are based on vector diffraction theory where the field distribution at the focus can be confirmed by beam input conditions. The radial polarized excitation beam was compared with PSF distribution of amplitude modulation and phase modulation. We also confirmed that the STED effect is more effective by adding the term related to the depletion beam. Simulation results show that the beam spot size of the excitation beam of phase modulation is about 20% higher than that of amplitude modulation. In the latter case, the sidelobe appeared to be somewhat evident, but it was confirmed that it was possible to suppress effectively through the depletion beam. As a result, the resolution of the CW STED microscope was increased. Experimental method was composed of 2 paths and experiment was performed by replacing the amplitude aperture and the phase aperture at the same position in the excitation beam path. In addition, general STED cases were also compared. Both apertures used in the experiments were made of quartz. Amplitude modulation was blocked by chrome masking at a certain rate, and phase modulation delayed the half wavelength with a thickness of 527 nm. The experiment proceeded to imaging Fluorescence bead and Bio sample. First, we confirmed the overall resolution improvement and the STED effect with the fluorescence bead. As a result, it was confirmed that the proposed method is similar to the conventional amplitude modulation and shows about 30% improvement compared to the conventional STED. The phase aperture was fabricated by lithography (a little more detail) than the quartz. The difference between the part and the non-part of the delay part was determined to be 527nm by calculating d = λΔφ / 2π (n-1) for the part of the etched part and the part for the phase delay. It was designed as a ring type. First, to verify the overall feasibility, simulation and experiment were conducted by making the number of phase delay from one to three. They were named pattern 1 ~ 3 respectively. The 4f system was applied to mitigate the diffraction. Analysis of the simulation results showed that confocal at pattern 1 had a resolution of 166 nm. It showed 20nm improvement compared to existing confocal (186nm). This greatly increased STED efficiency. In the experiment, however, the focal plane was longer and tended to split in the xz plane from pattern2. This resulted in experimental results with a sense of distance from the simulation results. Experiments were carried out on pattern1, which showed the best effect, and data were obtained for each STED power. Exponential curve was confirmed. STED efficiency compared to conventional STED, that is, resolution was high. Based on these results, we named it RPP-CW STED and its origin is Radial polarization phase. This study suggests that the resolution of existing CW STED is overcome by using radial polarization and phase plate. Based on this research, I hope to develop a more advanced STED microscope
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