[학위논문]Development of lipidomic and proteomic analysis method for subcellular species using flow field-flow fractionation and nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry원문보기
양준선
(Graduate School, Yonsei University
Department of Chemistry
국내박사)
세포 소기관은 세포를 구성하고 있는 독립적인 기관으로서 DNA, RNA, 단백질과 같은 생체분자를 생성한다. 또한 세포는 세포 외 소낭 중 하나인 엑소좀을 통해 세포 내에서 필요 없는 물질을 제거할 뿐만 아니라 주변 세포와 지질, 단백질 등을 전달하여 세포간 교신을 이룬다. 엑소좀과 세포 소기관은 세포의 활동에 필수적인 요소이기 때문에 이들을 구성하는 단백질, 지질을 분석하면 이들의 ...
세포 소기관은 세포를 구성하고 있는 독립적인 기관으로서 DNA, RNA, 단백질과 같은 생체분자를 생성한다. 또한 세포는 세포 외 소낭 중 하나인 엑소좀을 통해 세포 내에서 필요 없는 물질을 제거할 뿐만 아니라 주변 세포와 지질, 단백질 등을 전달하여 세포간 교신을 이룬다. 엑소좀과 세포 소기관은 세포의 활동에 필수적인 요소이기 때문에 이들을 구성하는 단백질, 지질을 분석하면 이들의 생체 내 역할에 대한 이해와 이와 연관된 질병에 대한 연구를 수행할 수 있다. 하지만 현재까지 소기관이나 엑소좀을 복잡한 시료 내에서 크기 별로 분리하기 위해선 오랜 전처리 과정이 걸리기 때문에 이러한 단점을 극복한 새로운 분리방법의 개발이 필수적이라고 할 수 있다. 본 연구에서는 흐름장-흐름 분획법과 나노유속 액체크로마토그래피-탠덤질량분석법을 활용하여 엑소좀과 세포 소기관의 단백체, 지질체를 분석하는 방법을 개발하였다. 첫 번째 장에서는 HEK293T 세포의 소기관을 비대칭 흐름장-흐름 분획법을 이용하여 15분 내로 분리하고 이를 통해 분리 된 소기관의 단백질 분석을 수행하였다. 두 번째 장에서는 뇨시료 내 엑소좀을 비대칭 흐름장-흐름 분획법을 이용해 크기 별로 분리하였으며 전립선 암 환자와 정상인 그룹 간의 크기 비교를 수행 한 후 엑소좀의 크기에 따라 지질 분석을 수행하여 전립선 암과 연관되어 있을 것으로 예상되는 엑소좀 내 지질체 바이오마커 후보군을 검출하였다. 세 번째 장에서는 HEK293 세포에 과산화수소를 이용해 산화스트레스를 유발 한 뒤 정상군과 스트레스 군의 세포 소기관과 엑소좀 모두 흐름장-흐름 분획법을 통해 비교하고 산화된 인지질의 변화를 살펴보았다. 세포 소기관과 엑소좀에 대한 연구뿐만 아니라 본 연구에서는 두꺼운 스페이서를 사용한 흐름장-흐름 분획법을 활용하여 저분자량 단백질을 효율적으로 분리 할 수 있는 최적화 된 유속을 찾는 연구를 수행하였다. 마지막 장에서는 세포의 전사 후 변형 과정에서 나타나는 글라이코실화 된 단백질을 빠른 시간 안에 온라인으로 분석하기 위해 열감응-다공성 고분자 막 반응기 (TPPMR)를 개발하였으며 이를 사용하여 당단백질을 한 시간 내에 분석할 수 있는 새로운 분석법을 개발 하였다.
세포 소기관은 세포를 구성하고 있는 독립적인 기관으로서 DNA, RNA, 단백질과 같은 생체분자를 생성한다. 또한 세포는 세포 외 소낭 중 하나인 엑소좀을 통해 세포 내에서 필요 없는 물질을 제거할 뿐만 아니라 주변 세포와 지질, 단백질 등을 전달하여 세포간 교신을 이룬다. 엑소좀과 세포 소기관은 세포의 활동에 필수적인 요소이기 때문에 이들을 구성하는 단백질, 지질을 분석하면 이들의 생체 내 역할에 대한 이해와 이와 연관된 질병에 대한 연구를 수행할 수 있다. 하지만 현재까지 소기관이나 엑소좀을 복잡한 시료 내에서 크기 별로 분리하기 위해선 오랜 전처리 과정이 걸리기 때문에 이러한 단점을 극복한 새로운 분리방법의 개발이 필수적이라고 할 수 있다. 본 연구에서는 흐름장-흐름 분획법과 나노유속 액체크로마토그래피-탠덤질량분석법을 활용하여 엑소좀과 세포 소기관의 단백체, 지질체를 분석하는 방법을 개발하였다. 첫 번째 장에서는 HEK293T 세포의 소기관을 비대칭 흐름장-흐름 분획법을 이용하여 15분 내로 분리하고 이를 통해 분리 된 소기관의 단백질 분석을 수행하였다. 두 번째 장에서는 뇨시료 내 엑소좀을 비대칭 흐름장-흐름 분획법을 이용해 크기 별로 분리하였으며 전립선 암 환자와 정상인 그룹 간의 크기 비교를 수행 한 후 엑소좀의 크기에 따라 지질 분석을 수행하여 전립선 암과 연관되어 있을 것으로 예상되는 엑소좀 내 지질체 바이오마커 후보군을 검출하였다. 세 번째 장에서는 HEK293 세포에 과산화수소를 이용해 산화스트레스를 유발 한 뒤 정상군과 스트레스 군의 세포 소기관과 엑소좀 모두 흐름장-흐름 분획법을 통해 비교하고 산화된 인지질의 변화를 살펴보았다. 세포 소기관과 엑소좀에 대한 연구뿐만 아니라 본 연구에서는 두꺼운 스페이서를 사용한 흐름장-흐름 분획법을 활용하여 저분자량 단백질을 효율적으로 분리 할 수 있는 최적화 된 유속을 찾는 연구를 수행하였다. 마지막 장에서는 세포의 전사 후 변형 과정에서 나타나는 글라이코실화 된 단백질을 빠른 시간 안에 온라인으로 분석하기 위해 열감응-다공성 고분자 막 반응기 (TPPMR)를 개발하였으며 이를 사용하여 당단백질을 한 시간 내에 분석할 수 있는 새로운 분석법을 개발 하였다.
Subcellular organelles in cells are independent organs which produce essential biomolecules such as DNA, RNA, and proteins. In addition, cells not only communicate to recipient cells by proteins or lipids but also dispose unnecessary molecules during exocytosis using extracellular vesicles called ex...
Subcellular organelles in cells are independent organs which produce essential biomolecules such as DNA, RNA, and proteins. In addition, cells not only communicate to recipient cells by proteins or lipids but also dispose unnecessary molecules during exocytosis using extracellular vesicles called exosome. As exosomes or organelles are essential for cell activity, analyzing proteins or lipids that constitute them enables understanding their biological role and can be the basis of related disease study. Therefore, it is important to separate them from complex biological samples in order to perform these studies efficiently. However, lipidomic and proteomic studies for organelles or exosomes have been carried out using an ultracentrifugation method which is time consuming and the isolation efficiency. Furthermore, confirmation of separation is usually achieved by an electron microscope or a nanoparticle tracking analysis (NTA). Therefore, it is necessary to develop an alternative size-based sorting method to overcome these drawbacks. In this study, proteomic and lipidomic analysis method based on flow field-flow fractionation (FlFFF) and nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry was developed for subcellular species. Subcellular organelles of HEK293T cell homogenate were separated by sizes using FlFFF. Separated organelles were subjected to further confirmation by scanning electron microscopy (SEM), Western blot, and proteomic analysis by nLC-ESI-MS/MS. Secondly, studied was the size distribution of urinary exosomes from healthy controls and prostate cancer (PCa) patients by FlFFF. In addition, exosome lipids were analyzed by nLC-ESI-MS/MS according to the size of exosome and biomarker candidates for PCa were investigated. The third part is the study of the effects of oxidative stress on exosome and organelle. Investigation of changes in organelle and exosome was carried out by FlFFF and subsequent lipidomic analysis was performed by nLC-ESI-MS/MS to compare the oxidative stress effect on organelle and exosome. Moreover, analysis of oxidized phospholipids in organelle and exosome level was also performed Besides the studies on subcellular species, optimization of flow rate condition in a thicker spacer in FlFFF was preceded for high resolution separation of low molecular weight proteins or polymers. The last part of this study was development of a new fully automated analytical method for glycopeptides using thermo-responsive porous polymer membrane reactor (TPPMR). With the help of dual TPPMR, glycoproteins could be analyzed within 1 hours.
Subcellular organelles in cells are independent organs which produce essential biomolecules such as DNA, RNA, and proteins. In addition, cells not only communicate to recipient cells by proteins or lipids but also dispose unnecessary molecules during exocytosis using extracellular vesicles called exosome. As exosomes or organelles are essential for cell activity, analyzing proteins or lipids that constitute them enables understanding their biological role and can be the basis of related disease study. Therefore, it is important to separate them from complex biological samples in order to perform these studies efficiently. However, lipidomic and proteomic studies for organelles or exosomes have been carried out using an ultracentrifugation method which is time consuming and the isolation efficiency. Furthermore, confirmation of separation is usually achieved by an electron microscope or a nanoparticle tracking analysis (NTA). Therefore, it is necessary to develop an alternative size-based sorting method to overcome these drawbacks. In this study, proteomic and lipidomic analysis method based on flow field-flow fractionation (FlFFF) and nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry was developed for subcellular species. Subcellular organelles of HEK293T cell homogenate were separated by sizes using FlFFF. Separated organelles were subjected to further confirmation by scanning electron microscopy (SEM), Western blot, and proteomic analysis by nLC-ESI-MS/MS. Secondly, studied was the size distribution of urinary exosomes from healthy controls and prostate cancer (PCa) patients by FlFFF. In addition, exosome lipids were analyzed by nLC-ESI-MS/MS according to the size of exosome and biomarker candidates for PCa were investigated. The third part is the study of the effects of oxidative stress on exosome and organelle. Investigation of changes in organelle and exosome was carried out by FlFFF and subsequent lipidomic analysis was performed by nLC-ESI-MS/MS to compare the oxidative stress effect on organelle and exosome. Moreover, analysis of oxidized phospholipids in organelle and exosome level was also performed Besides the studies on subcellular species, optimization of flow rate condition in a thicker spacer in FlFFF was preceded for high resolution separation of low molecular weight proteins or polymers. The last part of this study was development of a new fully automated analytical method for glycopeptides using thermo-responsive porous polymer membrane reactor (TPPMR). With the help of dual TPPMR, glycoproteins could be analyzed within 1 hours.
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