북방전복(Haliotis discus hannai)의 성장 관련 유전자 및 장내미생물 군집 특성 분석 Characterization of Growth-Related Genes and Intestinal Microbiota in Pacific Abalone (Haliotis discus hannai)원문보기
북방전복(Haliotis discus hannai)은 우리나라의 주요 양식대상 종으로 생산량의 90% 이상이 전남지역의 해상가두리에서 양식 생산되고 있다. 우리나라의 전복 양식 생산량은 2000년대 이후로 해상가두리 도입과 양식기술 발달로 급격한 성장을 하였지만 최근에는 입식량 대비 출하량이 감소하는 문제점을 보인다. 이는 종묘생산단계에서의 높은 폐사율 및 가두리 내에서의 느린 성장률이 원인인 것으로 파악된다. 따라서 본 연구에서는 전복의 성장에 초점을 맞추어 성장에 따른 발현차이를 보이는 유전자를 6개 선정하여 그 중 두 가지의 유전자를 이용해 전복의 성 구분 및 성에 따른 성장차이를 비교하는 분석을 진행하였다. 또 다른 성장관련 유전자는 면역과 관련하여, 이를 암호화하는 유전자의 특성과 재조합 단백질에서의 향균활성을 분석하는 실험을 진행하였다. 마지막으로 전복의 크기에 따른 ...
북방전복(Haliotis discus hannai)은 우리나라의 주요 양식대상 종으로 생산량의 90% 이상이 전남지역의 해상가두리에서 양식 생산되고 있다. 우리나라의 전복 양식 생산량은 2000년대 이후로 해상가두리 도입과 양식기술 발달로 급격한 성장을 하였지만 최근에는 입식량 대비 출하량이 감소하는 문제점을 보인다. 이는 종묘생산단계에서의 높은 폐사율 및 가두리 내에서의 느린 성장률이 원인인 것으로 파악된다. 따라서 본 연구에서는 전복의 성장에 초점을 맞추어 성장에 따른 발현차이를 보이는 유전자를 6개 선정하여 그 중 두 가지의 유전자를 이용해 전복의 성 구분 및 성에 따른 성장차이를 비교하는 분석을 진행하였다. 또 다른 성장관련 유전자는 면역과 관련하여, 이를 암호화하는 유전자의 특성과 재조합 단백질에서의 향균활성을 분석하는 실험을 진행하였다. 마지막으로 전복의 크기에 따른 장내미생물 군집 구조를 비교, 분석하고자 마이크로비옴 분석을 수행하였다.
- 북방전복의 성장에 따라 발현의 차이를 보이는 유전자의 선정 북방전복의 성장에 따라 발현 차이를 보이는 유전자를 발굴하기 위하여 1:1 교배로 얻은 치패를 크기 별로 small, medium, large group으로 구분하였다. 그룹 별 개체들의 연조직에서 total RNA를 분리한 후 RNASeq을 통한 전사체 분석을 수행하였고 후보군 유전자들을 선정하여 다른 가계의 실험군을 이용해 2차 검정을 한 결과, 최종적으로 6개의 유전자(Incilarin A, Perlucin[Tsc5], Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3, Tomoregulin-2, Vitelline envelope zona pellucida domain 4[Tsc34], Defensin)가 small과 large그룹 사이에서 유의한 발현차이를 보였으며 조직별 발현을 확인하였다.
- 속성장 관련 유전자 Tsc34(ZP4)를 이용한 암컷의 구분 및 이를 이용한 성에 따른 성장차이 규명 Vitelline envelope zona pellucida domain 4(ZP4)은 난막을 둘러싸는 당단백질로써 암컷의 생식소에서 특이적인 발현을 관찰하였다. 문헌조사를 통해 암, 수의 생식소와 관련이 있다고 알려진 여러 유전자를 성 숙한 암수개체의 생식소를 이용하여 평가한 결과, 최종적으로 암컷 생식소에 특이적인 ZP4, 수컷 생식소에특이적인 Sperm Protein(SP)과 Lysin(Lys)을 각각 암수 구분 마커로서 본 실험에서 사용하였다. 발달 단계별로 해당 성 구분 마커의 최초 발현시기를 RT-PCR을 통해 관찰한 결과, 각장 17.5mm인 수정 후 200일 개체에서부터 세 가지 마커를 이용한 성 구분이 가능함을 알 수 있었다. 또한 해당 마커들을 이용해 각기 다른 네 지역의 가두리 내 암/수 출현 빈도를 조사한 결과, 암컷의 출현 빈도가 상대적으로 높은 것을 알 수 있었다. 또한 암/수의 각장을 비교한 실험에서 암컷의 각장이 더 큰 것을 확인하였으며 따라서 북방전복의 암컷이 수컷에 비하여 비교적 빨리 자란다는 가능성을 제시할 수 있었다.
- 속성장 관련 유전자 Tsc5(CTLD)의 향균활성 속성장 유전자 Tsc5의 유전자 구조 분석 결과, 해당 유전자는 3 개의 exon으로 구성되어 있었으며 145개의 아미노산을 암호화 하는 438bp의 open reading frame으로 구성되어 있었다. 아미노산 서열을 비교하였을 때 H. laevigata 와 H. discus discus의 Perlucin 서열과 각각 64.9%와 52.5%의 상동성을 보였다. 어류 및 연체동물에서 발견되는 C-type lectin domain(CTLD)-containing protein과 함께 비교 하였을 때, 북방전복의 CTLD에 보존된 여섯 개의 cysteine잔기들과 carbohydrate recognition domain (CRD)의 역할을 한다고 알려진 QPD 및 WND motif를 발견하였다. 또한 ligand 예측 프로그램을 통하여 해당 서열에 Ca2+이온 및 mannose가 상호작용할 수 있는 구역을 예측할 수 있었다. 초기발생단계의 유생들과 발달단계별 치패들 사이의 해당 유전자 발현을 관찰하였을 때 초기발생단계를 지나 수정 후 50일째부터 발현하여 수정 후 100일과 150일에서 강한 발현을 관찰할 수 있었다. Tsc5의 in vitro상에서의 향균력을 시험하기 위해 E. coliBL21(DE3) codon plus strain 및 pET44a vector를 이용하여 c말단의 his6-tag가 추가된 재조합 단백질을 발현 및 affinity purification 과 RP-HPLC를 통해 정제하였다. 정제된 약 18.3kDa 의 재조합 단백질은 그람 양성균인 Bacillus subtilis, Streptococcus iniae, Lactococcus garviea와 그람 음성균인 Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi에 대한 향균력을 나타내었다.
- 전복의 성장에 따른 장내미생물 군집의 구조 수정 후 750일인 북방전복 장내의 미생물 군집을 크기별로 비교, 분석하기 위해서 사료를 공급한 육상수조(indoor tank, IT)에서 사육한 개체가 사용되었으며 각각 크기에 따라서 small(ITS)과 large(ITL)로 분류하였다. 이들의 장내 16S rDNA 서열을 이용한 미생물 군집 분석 결과, 대체적으로 Tenericutes문이 우점하고 있었으나 ITS그룹에서는 Proteobacteria문이 우점하고 있었다. pCoA(principal coordinates analysis)를 2D 상에서 나타내었을 때 ITL과 ITS의 경우 샘플들 간의 뚜렷한 clustering을 관찰할 수 있었다. 이를 통해 ITL/ITS를 비교할 시 ITS그룹이 ITL그룹 보다 유의적으로 높은 종 다양성 및 종 풍부도 지수 값을 가지며, BMI가 높았던 ITL에서의 Firmicutes 대 Bacteroidetes비(F/B ratio)가 ITS에서의 것 보다 유의적으로 높은 것을 통하여 포유류에서 연구된 결과와 상응하는 것을 알 수 있다. 또한 두 그룹에서 장내에 우점하고 있는 속인 Psychrilyobacter의 경우 숙주의 면역과 에너지생산에 관여하는 short-chain fatty acid(SCFA)의 생산력을 기대해 볼 수 있다.
북방전복(Haliotis discus hannai)은 우리나라의 주요 양식대상 종으로 생산량의 90% 이상이 전남지역의 해상가두리에서 양식 생산되고 있다. 우리나라의 전복 양식 생산량은 2000년대 이후로 해상가두리 도입과 양식기술 발달로 급격한 성장을 하였지만 최근에는 입식량 대비 출하량이 감소하는 문제점을 보인다. 이는 종묘생산단계에서의 높은 폐사율 및 가두리 내에서의 느린 성장률이 원인인 것으로 파악된다. 따라서 본 연구에서는 전복의 성장에 초점을 맞추어 성장에 따른 발현차이를 보이는 유전자를 6개 선정하여 그 중 두 가지의 유전자를 이용해 전복의 성 구분 및 성에 따른 성장차이를 비교하는 분석을 진행하였다. 또 다른 성장관련 유전자는 면역과 관련하여, 이를 암호화하는 유전자의 특성과 재조합 단백질에서의 향균활성을 분석하는 실험을 진행하였다. 마지막으로 전복의 크기에 따른 장내미생물 군집 구조를 비교, 분석하고자 마이크로비옴 분석을 수행하였다.
- 북방전복의 성장에 따라 발현의 차이를 보이는 유전자의 선정 북방전복의 성장에 따라 발현 차이를 보이는 유전자를 발굴하기 위하여 1:1 교배로 얻은 치패를 크기 별로 small, medium, large group으로 구분하였다. 그룹 별 개체들의 연조직에서 total RNA를 분리한 후 RNASeq을 통한 전사체 분석을 수행하였고 후보군 유전자들을 선정하여 다른 가계의 실험군을 이용해 2차 검정을 한 결과, 최종적으로 6개의 유전자(Incilarin A, Perlucin[Tsc5], Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3, Tomoregulin-2, Vitelline envelope zona pellucida domain 4[Tsc34], Defensin)가 small과 large그룹 사이에서 유의한 발현차이를 보였으며 조직별 발현을 확인하였다.
- 속성장 관련 유전자 Tsc34(ZP4)를 이용한 암컷의 구분 및 이를 이용한 성에 따른 성장차이 규명 Vitelline envelope zona pellucida domain 4(ZP4)은 난막을 둘러싸는 당단백질로써 암컷의 생식소에서 특이적인 발현을 관찰하였다. 문헌조사를 통해 암, 수의 생식소와 관련이 있다고 알려진 여러 유전자를 성 숙한 암수개체의 생식소를 이용하여 평가한 결과, 최종적으로 암컷 생식소에 특이적인 ZP4, 수컷 생식소에특이적인 Sperm Protein(SP)과 Lysin(Lys)을 각각 암수 구분 마커로서 본 실험에서 사용하였다. 발달 단계별로 해당 성 구분 마커의 최초 발현시기를 RT-PCR을 통해 관찰한 결과, 각장 17.5mm인 수정 후 200일 개체에서부터 세 가지 마커를 이용한 성 구분이 가능함을 알 수 있었다. 또한 해당 마커들을 이용해 각기 다른 네 지역의 가두리 내 암/수 출현 빈도를 조사한 결과, 암컷의 출현 빈도가 상대적으로 높은 것을 알 수 있었다. 또한 암/수의 각장을 비교한 실험에서 암컷의 각장이 더 큰 것을 확인하였으며 따라서 북방전복의 암컷이 수컷에 비하여 비교적 빨리 자란다는 가능성을 제시할 수 있었다.
- 속성장 관련 유전자 Tsc5(CTLD)의 향균활성 속성장 유전자 Tsc5의 유전자 구조 분석 결과, 해당 유전자는 3 개의 exon으로 구성되어 있었으며 145개의 아미노산을 암호화 하는 438bp의 open reading frame으로 구성되어 있었다. 아미노산 서열을 비교하였을 때 H. laevigata 와 H. discus discus의 Perlucin 서열과 각각 64.9%와 52.5%의 상동성을 보였다. 어류 및 연체동물에서 발견되는 C-type lectin domain(CTLD)-containing protein과 함께 비교 하였을 때, 북방전복의 CTLD에 보존된 여섯 개의 cysteine잔기들과 carbohydrate recognition domain (CRD)의 역할을 한다고 알려진 QPD 및 WND motif를 발견하였다. 또한 ligand 예측 프로그램을 통하여 해당 서열에 Ca2+이온 및 mannose가 상호작용할 수 있는 구역을 예측할 수 있었다. 초기발생단계의 유생들과 발달단계별 치패들 사이의 해당 유전자 발현을 관찰하였을 때 초기발생단계를 지나 수정 후 50일째부터 발현하여 수정 후 100일과 150일에서 강한 발현을 관찰할 수 있었다. Tsc5의 in vitro상에서의 향균력을 시험하기 위해 E. coli BL21(DE3) codon plus strain 및 pET44a vector를 이용하여 c말단의 his6-tag가 추가된 재조합 단백질을 발현 및 affinity purification 과 RP-HPLC를 통해 정제하였다. 정제된 약 18.3kDa 의 재조합 단백질은 그람 양성균인 Bacillus subtilis, Streptococcus iniae, Lactococcus garviea와 그람 음성균인 Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi에 대한 향균력을 나타내었다.
- 전복의 성장에 따른 장내미생물 군집의 구조 수정 후 750일인 북방전복 장내의 미생물 군집을 크기별로 비교, 분석하기 위해서 사료를 공급한 육상수조(indoor tank, IT)에서 사육한 개체가 사용되었으며 각각 크기에 따라서 small(ITS)과 large(ITL)로 분류하였다. 이들의 장내 16S rDNA 서열을 이용한 미생물 군집 분석 결과, 대체적으로 Tenericutes문이 우점하고 있었으나 ITS그룹에서는 Proteobacteria문이 우점하고 있었다. pCoA(principal coordinates analysis)를 2D 상에서 나타내었을 때 ITL과 ITS의 경우 샘플들 간의 뚜렷한 clustering을 관찰할 수 있었다. 이를 통해 ITL/ITS를 비교할 시 ITS그룹이 ITL그룹 보다 유의적으로 높은 종 다양성 및 종 풍부도 지수 값을 가지며, BMI가 높았던 ITL에서의 Firmicutes 대 Bacteroidetes비(F/B ratio)가 ITS에서의 것 보다 유의적으로 높은 것을 통하여 포유류에서 연구된 결과와 상응하는 것을 알 수 있다. 또한 두 그룹에서 장내에 우점하고 있는 속인 Psychrilyobacter의 경우 숙주의 면역과 에너지생산에 관여하는 short-chain fatty acid(SCFA)의 생산력을 기대해 볼 수 있다.
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