중금속을 감지하는 대장균 기반 바이오센서는 기기분석에 비해 간단하고, 전문성를 요하지 않으며, 생체이용률을 구할 수 있는 장점을 가진다. 하지만 이러한 장점에도 불구하고 감지 감도의 부족, 넓은 선택성, 오페론 수의 제한으로 인한 개발의 어려움 등이 바이오센서를 현장에서 적용하는데 난점으로 존재한다. 이를 해결하기 위하여 본 연구에서는 먼저 구리 감지 바이오센서의 감도부족을 금속 항상성 조절 시스템의 조작을 통하여 해결하였다. 항상성 조절에 관련된 단백질 copA의 제거를 통해 구리 이온의 내부 축척을 유도하여 구리 항상성 조절시스템을 방해하였다. 또 구리이온에 결합하는 cueR양의 조절을 통하여 감도를 최적화하였다. 두 번째로 비소와 ...
중금속을 감지하는 대장균 기반 바이오센서는 기기분석에 비해 간단하고, 전문성를 요하지 않으며, 생체이용률을 구할 수 있는 장점을 가진다. 하지만 이러한 장점에도 불구하고 감지 감도의 부족, 넓은 선택성, 오페론 수의 제한으로 인한 개발의 어려움 등이 바이오센서를 현장에서 적용하는데 난점으로 존재한다. 이를 해결하기 위하여 본 연구에서는 먼저 구리 감지 바이오센서의 감도부족을 금속 항상성 조절 시스템의 조작을 통하여 해결하였다. 항상성 조절에 관련된 단백질 copA의 제거를 통해 구리 이온의 내부 축척을 유도하여 구리 항상성 조절시스템을 방해하였다. 또 구리이온에 결합하는 cueR양의 조절을 통하여 감도를 최적화하였다. 두 번째로 비소와 안티몬에 반응하는 조절단백질 arsR의 금속결합부위(MBL)를 조작하였다. 37번 시스테인의 제거 및 위치의 재배치를 통하여 비소 이온과의 결합을 최소화시키고 안티몬과의 결합 정도를 증가시켜, 안티몬 감지 바이오센서를 제작하였다. 세 번째로 오페론 수의 제한으로 인한 바이오센서 개발의 제한을 해결하기 위하여 제작 단계에서 스트레스-반응 오페론의 이용을배제하고, 리포터유전자를 이용하여 금속에 결합할 수 있게 리포터유전자 eGFP를 조작하였다. eGFP의 아미노산 구역 1-9와 10-11을 분리시킨 뒤, 분리된 루프에 카드뮴 및 수은에 결합하는 조절단백질 zntR을 기반으로 하는 MBL을 삽입하였다. 그 결과, MBL에 카드뮴 이온이 결합할 때, eGFP의 분리된 단편이 가까워지면서 카드뮴 이온에 결합할 때 형광신호를 나타냈다. 이를 통하여 리포터유전자 만으로 측정 가능한 바이오센서를 제작하였다.
중금속을 감지하는 대장균 기반 바이오센서는 기기분석에 비해 간단하고, 전문성를 요하지 않으며, 생체이용률을 구할 수 있는 장점을 가진다. 하지만 이러한 장점에도 불구하고 감지 감도의 부족, 넓은 선택성, 오페론 수의 제한으로 인한 개발의 어려움 등이 바이오센서를 현장에서 적용하는데 난점으로 존재한다. 이를 해결하기 위하여 본 연구에서는 먼저 구리 감지 바이오센서의 감도부족을 금속 항상성 조절 시스템의 조작을 통하여 해결하였다. 항상성 조절에 관련된 단백질 copA의 제거를 통해 구리 이온의 내부 축척을 유도하여 구리 항상성 조절시스템을 방해하였다. 또 구리이온에 결합하는 cueR양의 조절을 통하여 감도를 최적화하였다. 두 번째로 비소와 안티몬에 반응하는 조절단백질 arsR의 금속결합부위(MBL)를 조작하였다. 37번 시스테인의 제거 및 위치의 재배치를 통하여 비소 이온과의 결합을 최소화시키고 안티몬과의 결합 정도를 증가시켜, 안티몬 감지 바이오센서를 제작하였다. 세 번째로 오페론 수의 제한으로 인한 바이오센서 개발의 제한을 해결하기 위하여 제작 단계에서 스트레스-반응 오페론의 이용을배제하고, 리포터유전자를 이용하여 금속에 결합할 수 있게 리포터유전자 eGFP를 조작하였다. eGFP의 아미노산 구역 1-9와 10-11을 분리시킨 뒤, 분리된 루프에 카드뮴 및 수은에 결합하는 조절단백질 zntR을 기반으로 하는 MBL을 삽입하였다. 그 결과, MBL에 카드뮴 이온이 결합할 때, eGFP의 분리된 단편이 가까워지면서 카드뮴 이온에 결합할 때 형광신호를 나타냈다. 이를 통하여 리포터유전자 만으로 측정 가능한 바이오센서를 제작하였다.
E. coli-based biosensors that detect heavy metals are simple, not require expertise compared to instrumental analysis, and the most important advantage of biosensors is the capability of measuring bioavailability. However, the lack of sensitivity, wide selectivity, and difficulty in development due ...
E. coli-based biosensors that detect heavy metals are simple, not require expertise compared to instrumental analysis, and the most important advantage of biosensors is the capability of measuring bioavailability. However, the lack of sensitivity, wide selectivity, and difficulty in development due to the limited number of genetic systems make hard to apply biosensors for practical monitoring in environmental systems. In order to solve low sensitivity, we used mutant E. coli strain that lost a gene named as copA involved in copper transporting system. Removal of the copA encoding copper transporting protein caused the internal accumulation of copper ions in E. coli by interfering the copper homeostasis control system. In addition, the amount of cueR which is transcriptional regulator known to interact with copper ions was critical to optimize sensitivity. Secondly, the metal binding site (MBL) of the regulatory protein arsR which response to arsenic and antimony was engineered. The antimony-response biosensor was engineered by minimizing the binding of arsenic ions and increasing the binding of antimony ion by removing the 37 cysteine and relocating the position. Third, in order to solve the limitation of biosensor development due to the limitation of the operon's diversity, the reporter gene eGFP was engineered to eliminate the use of the stress-response operon in the manufacturing stage and to bind to the metal using the reporter gene. MBL which binds to cadmium and mercury based on the regulatory protein zntR, was inserted into the separated loop After separating the amino acid regions 1-9 and 10-11 of eGFP, As a result, when cadmium ions were combined to MBL, the separated fragment of eGFP was closer and showed a fluorescent signal. Through this, we made a new a biosensor that are not based on stress-response operon.
E. coli-based biosensors that detect heavy metals are simple, not require expertise compared to instrumental analysis, and the most important advantage of biosensors is the capability of measuring bioavailability. However, the lack of sensitivity, wide selectivity, and difficulty in development due to the limited number of genetic systems make hard to apply biosensors for practical monitoring in environmental systems. In order to solve low sensitivity, we used mutant E. coli strain that lost a gene named as copA involved in copper transporting system. Removal of the copA encoding copper transporting protein caused the internal accumulation of copper ions in E. coli by interfering the copper homeostasis control system. In addition, the amount of cueR which is transcriptional regulator known to interact with copper ions was critical to optimize sensitivity. Secondly, the metal binding site (MBL) of the regulatory protein arsR which response to arsenic and antimony was engineered. The antimony-response biosensor was engineered by minimizing the binding of arsenic ions and increasing the binding of antimony ion by removing the 37 cysteine and relocating the position. Third, in order to solve the limitation of biosensor development due to the limitation of the operon's diversity, the reporter gene eGFP was engineered to eliminate the use of the stress-response operon in the manufacturing stage and to bind to the metal using the reporter gene. MBL which binds to cadmium and mercury based on the regulatory protein zntR, was inserted into the separated loop After separating the amino acid regions 1-9 and 10-11 of eGFP, As a result, when cadmium ions were combined to MBL, the separated fragment of eGFP was closer and showed a fluorescent signal. Through this, we made a new a biosensor that are not based on stress-response operon.
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