사카로마이세스 세레비지애는 전통적인 맥주, 빵 등 다양한 발효식품에 이용 널리 이용되는 균주이다. 최근 효모는 바이오기반의 기능성 소재 생산을 위한 숙주 균주로 가능성을 인정받고 있다. 하지만 효모는 자연상태에서는 포도당을 기질로 배양하였을 때, 에탄올을 과도하게 생산하기 때문에 고효율적으로 기능성 소재 생산을 생산하는 것이 어렵다. 따라서 대사공학적인 방법을 이용하여 에탄올 대사를 제어하거나 배양조건의 조절을 통해 에탄올 생성을 줄이고 목적생산물을 생산하도록 유도하는 것이 필수적이다. 본 연구에서는 효모의 에탄올 대사를 감소하기 위한 방안으로 대사공학적 제어방법을 고안하였다. 에탄올과 ...
사카로마이세스 세레비지애는 전통적인 맥주, 빵 등 다양한 발효식품에 이용 널리 이용되는 균주이다. 최근 효모는 바이오기반의 기능성 소재 생산을 위한 숙주 균주로 가능성을 인정받고 있다. 하지만 효모는 자연상태에서는 포도당을 기질로 배양하였을 때, 에탄올을 과도하게 생산하기 때문에 고효율적으로 기능성 소재 생산을 생산하는 것이 어렵다. 따라서 대사공학적인 방법을 이용하여 에탄올 대사를 제어하거나 배양조건의 조절을 통해 에탄올 생성을 줄이고 목적생산물을 생산하도록 유도하는 것이 필수적이다. 본 연구에서는 효모의 에탄올 대사를 감소하기 위한 방안으로 대사공학적 제어방법을 고안하였다. 에탄올과 글리세롤 합성 유전자인 ADH1, GPD1, GPD2를 효모의 지놈으로부터 제거하여 피루브산과 아세틸-CoA를 안정적으로 생산하는 효모균주를 확보하였다. 해당 균주의 세포 내 대사체 분석결과, 글리세롤 대사의 제거로 인해 삼투스트레스가 저해된 것을 알 수 있었으며 세포 내 시트르산의 함량이 야생형 균주에 비해 약 2.94배 증가한 것을 알 수 있었다. 또한 말레이트 생산을 위해 사카로마이세스 세레비지애 내부의 pyruvate carboxylase를 암호화하는 PYC2 유전자와 malate dehyderogenase를 암호화하는 MDH3ΔSKL 유전자, Schizosaccharomyces pombe 유래의 C4-dicarboxylic acid transporter 단백질을 암호화하는 SpmaeI 유전자를 효모에 도입한 균주를 구축하였다. 구축된 재조합 균주는 야생형에 비해 약 2.68배 증가한 malate 생산을 보였다. 추가로 앞선 대사체 분석결과를 참고하여 발현 MLS1ΔSKL 과 ICL1 유전자를 과발현하였으며, 세포 내 시트르산 이용율을 높이기 위해 말레이트 생산을 위한 발효준비과정에서 초기 포도당의 농도를 최적으로 조절하여 회분식배양을 실시하였다. 그 결과 약 10.7 g/L의 말레이트를 생산하였으며 같은 균주로 최소배지를 이용하여 유가식 배양을 실시한 결과, 약 21 g/L의 말레이트를 생산할 수 있었다. 에탄올 대사를 제어하는 다른 방안으로 배양공정의 조절을 통해 에탄올 대사를 감소시키고 (-)-알파-비사보롤을 생산하는 연구를 수행하였다. (-)-알파-비사보롤은 세스퀴테르펜 계열의 물질로 화장품이나 향료의 제조에 널리쓰이는 이소프레이드의 하나이다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9시스템 기반의 재조합 효모를 이용하여 이소프레노이드 대사를 강화하고 (-)-알파-비사보롤 생산경로를 도입하여 (-)-알파-비사보롤 생산 효모를 구축하였다. 우선 (-)-알파-비사보롤을 비롯한 세스퀴테르펜 계열 물질은 항균활성을 지니기 때문에 효모에서 (-)-알파-비사보롤을 생산하기 전 (-)-알파-비사보롤의 성장저해 능력를 먼저 시험해 보았다. 그 결과, 접종 OD 0.1과 0.5 조건에서는 최대 1 g/L까지, 초기 OD를 1.0으로 맞추어 배양하였을 때에는 3 g/L (-)-알파-비사보롤 이 포함되어도 성장이 확인되었다. 다음으로 (-)-알파-비사보롤의 생산은 산소공급 및 배양환경에 영향을 받을 수 있기 때문에 효율적인 (-)-알파-비사보롤 생산을 위한 최적의 포도당, rpm, 배지, 탄소원 및 pH조건을 탐색하였다. 최적의 배양 조건에서 회분식 배양을 시행한 결과 포도당으로부터 약11.7 mg/L의 (-)-알파-비사보롤을 생산할 수 있었다. 이를 통하여 재조합 사카로마이세 세레비지애에서 (-)-알파-비사보롤을 생산할 수 있음을 증명하였으며 최적의 (-)-알파-비사보롤 생산 조건을 확립하였다. 이와 더불어, 효모의 비효율적인 메발론산 대사경로를 개선하여 효율적인 (-)-알파 비사보롤 생산을 하고자 하였다. 메발론산 대사경로의 피드백 저해를 불러오는 HM1G1유전자의 일부를 잘라낸 tHMG1 유전자 발현시스템을 크리스퍼유전자가위 기술을 통해 사카로마이세스 세레비지애의 지놈으로 도입하였다. 구축된 Dt 균주는 비사보롤 합성유전자를 도입했을 때 (-)-알파-비사보롤 생산량이 약 5배 증가하였다. 효모 유래의 ERG10 유전자의 추가발현과 아세틸-CoA생합성의 주요 유전자인 아세틸-CoA 합성유전자를 추가로 과발현 한 결과, 최종적으로 구축된 균주 Dt-EMA는 포도당으로부터 약 75.2 mg/L의 (-)-알파-비사보롤을 생산하였다. 또한 MrBBS와 ACS1 유전자를 GAL1 프로모터와 결합하여 유전자 발현시스템을 변경한 균주의 회분식 배양결과 92.7 mg/L의 (-)-알파-비사보롤을 생산할 수 있었다. 최종적으로 발효부산물인 에탄올 생성을 제어하기 위해 공기주입량을 높게 조절한 결과 유가식 배양을 통해 약 307 mg/L의 (-)-알파-비사보롤을 재조합 효모로부터 생산하였다. 본 연구는 대사공학 및 배양공정 기반으로 효율적으로 에탄올대사를 제어하여 효모로부터 다양한 유기산과 이소프레노이드 계열 물질 생산 가능성을 제시한 점에서 의의를 가진다.
사카로마이세스 세레비지애는 전통적인 맥주, 빵 등 다양한 발효식품에 이용 널리 이용되는 균주이다. 최근 효모는 바이오기반의 기능성 소재 생산을 위한 숙주 균주로 가능성을 인정받고 있다. 하지만 효모는 자연상태에서는 포도당을 기질로 배양하였을 때, 에탄올을 과도하게 생산하기 때문에 고효율적으로 기능성 소재 생산을 생산하는 것이 어렵다. 따라서 대사공학적인 방법을 이용하여 에탄올 대사를 제어하거나 배양조건의 조절을 통해 에탄올 생성을 줄이고 목적생산물을 생산하도록 유도하는 것이 필수적이다. 본 연구에서는 효모의 에탄올 대사를 감소하기 위한 방안으로 대사공학적 제어방법을 고안하였다. 에탄올과 글리세롤 합성 유전자인 ADH1, GPD1, GPD2를 효모의 지놈으로부터 제거하여 피루브산과 아세틸-CoA를 안정적으로 생산하는 효모균주를 확보하였다. 해당 균주의 세포 내 대사체 분석결과, 글리세롤 대사의 제거로 인해 삼투스트레스가 저해된 것을 알 수 있었으며 세포 내 시트르산의 함량이 야생형 균주에 비해 약 2.94배 증가한 것을 알 수 있었다. 또한 말레이트 생산을 위해 사카로마이세스 세레비지애 내부의 pyruvate carboxylase를 암호화하는 PYC2 유전자와 malate dehyderogenase를 암호화하는 MDH3ΔSKL 유전자, Schizosaccharomyces pombe 유래의 C4-dicarboxylic acid transporter 단백질을 암호화하는 SpmaeI 유전자를 효모에 도입한 균주를 구축하였다. 구축된 재조합 균주는 야생형에 비해 약 2.68배 증가한 malate 생산을 보였다. 추가로 앞선 대사체 분석결과를 참고하여 발현 MLS1ΔSKL 과 ICL1 유전자를 과발현하였으며, 세포 내 시트르산 이용율을 높이기 위해 말레이트 생산을 위한 발효준비과정에서 초기 포도당의 농도를 최적으로 조절하여 회분식배양을 실시하였다. 그 결과 약 10.7 g/L의 말레이트를 생산하였으며 같은 균주로 최소배지를 이용하여 유가식 배양을 실시한 결과, 약 21 g/L의 말레이트를 생산할 수 있었다. 에탄올 대사를 제어하는 다른 방안으로 배양공정의 조절을 통해 에탄올 대사를 감소시키고 (-)-알파-비사보롤을 생산하는 연구를 수행하였다. (-)-알파-비사보롤은 세스퀴테르펜 계열의 물질로 화장품이나 향료의 제조에 널리쓰이는 이소프레이드의 하나이다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9시스템 기반의 재조합 효모를 이용하여 이소프레노이드 대사를 강화하고 (-)-알파-비사보롤 생산경로를 도입하여 (-)-알파-비사보롤 생산 효모를 구축하였다. 우선 (-)-알파-비사보롤을 비롯한 세스퀴테르펜 계열 물질은 항균활성을 지니기 때문에 효모에서 (-)-알파-비사보롤을 생산하기 전 (-)-알파-비사보롤의 성장저해 능력를 먼저 시험해 보았다. 그 결과, 접종 OD 0.1과 0.5 조건에서는 최대 1 g/L까지, 초기 OD를 1.0으로 맞추어 배양하였을 때에는 3 g/L (-)-알파-비사보롤 이 포함되어도 성장이 확인되었다. 다음으로 (-)-알파-비사보롤의 생산은 산소공급 및 배양환경에 영향을 받을 수 있기 때문에 효율적인 (-)-알파-비사보롤 생산을 위한 최적의 포도당, rpm, 배지, 탄소원 및 pH조건을 탐색하였다. 최적의 배양 조건에서 회분식 배양을 시행한 결과 포도당으로부터 약11.7 mg/L의 (-)-알파-비사보롤을 생산할 수 있었다. 이를 통하여 재조합 사카로마이세 세레비지애에서 (-)-알파-비사보롤을 생산할 수 있음을 증명하였으며 최적의 (-)-알파-비사보롤 생산 조건을 확립하였다. 이와 더불어, 효모의 비효율적인 메발론산 대사경로를 개선하여 효율적인 (-)-알파 비사보롤 생산을 하고자 하였다. 메발론산 대사경로의 피드백 저해를 불러오는 HM1G1유전자의 일부를 잘라낸 tHMG1 유전자 발현시스템을 크리스퍼 유전자가위 기술을 통해 사카로마이세스 세레비지애의 지놈으로 도입하였다. 구축된 Dt 균주는 비사보롤 합성유전자를 도입했을 때 (-)-알파-비사보롤 생산량이 약 5배 증가하였다. 효모 유래의 ERG10 유전자의 추가발현과 아세틸-CoA생합성의 주요 유전자인 아세틸-CoA 합성유전자를 추가로 과발현 한 결과, 최종적으로 구축된 균주 Dt-EMA는 포도당으로부터 약 75.2 mg/L의 (-)-알파-비사보롤을 생산하였다. 또한 MrBBS와 ACS1 유전자를 GAL1 프로모터와 결합하여 유전자 발현시스템을 변경한 균주의 회분식 배양결과 92.7 mg/L의 (-)-알파-비사보롤을 생산할 수 있었다. 최종적으로 발효부산물인 에탄올 생성을 제어하기 위해 공기주입량을 높게 조절한 결과 유가식 배양을 통해 약 307 mg/L의 (-)-알파-비사보롤을 재조합 효모로부터 생산하였다. 본 연구는 대사공학 및 배양공정 기반으로 효율적으로 에탄올대사를 제어하여 효모로부터 다양한 유기산과 이소프레노이드 계열 물질 생산 가능성을 제시한 점에서 의의를 가진다.
Saccharomyces cerevisiae is a GRAS-microorganism widely used in various fermented foods such as traditional beer and bread. Recently, it has been recognized as a potential host strain for the bio-based functional materials production. Naturally, S. cerevisiae produces high amount of ethanol by using...
Saccharomyces cerevisiae is a GRAS-microorganism widely used in various fermented foods such as traditional beer and bread. Recently, it has been recognized as a potential host strain for the bio-based functional materials production. Naturally, S. cerevisiae produces high amount of ethanol by using glucose as a substrate in the presence of oxygen as well as the absence of oxygen. Therefore, in order to produce bio-based functional material with high-efficiency, metabolic engineering of ethanol-producing pathways is required. In this study, the ADH1, GPD1, and GPD2 genes were inactivated from the yeast genome for efficient supply of pyruvic acid and acetyl-CoA to the malate synthetic pathway. Intracellular metabolite analysis revealed that metabolites related to osmotic stress were increased in D-A1G12 strain due to the removal of glycerol metabolism, and the content of citric acid was increased by a 2.94-fold compared with the strain without genetic modulation. The PYC2 gene encoding pyruvate carboxylase, the MDH3ΔSKL gene coding for malate dehydrogenase from S. cerevisiae, and the SpMAE1 gene encoding C4-dicarboxylic acid (C4-DA) transporter protein derived from Schizosaccharomyces pombe were introduced to wild-type S. cerevisiae strain for malate production. The constructed recombinant strain showed about 2.71 g/L malate production. Overexpression of the 3 genes for malate production in ADH1, GPD1 and GPD2 deficient strain resulted in 7.25 g/L malate production. In addition, the MLS1ΔSKL and ICL1 genes involved in the glyoxylate shunt were overexpressed based on the intracellular metabolite analysis results. The final S. cerevisiae strain produced 10.7 g/L of malate in a batch fermentation using 50 g/L glucose, and 21 g/L of malate production was achieved by a fed-batch culture using minimal media with 126.8 g/L glucose. (-)-α-Bisabolol is a sesquiterpene-based isoprenoid and is widely used in the manufacture of cosmetics and perfumes. In this study, (-)-α-bisabolol-producing S. cerevisiae strain of D-M was constructed by introducing MrBBS gene from German chamomile for its high production. Furthermore, truncated a HMG1 gene was overexpressed in the recombinant strain constructed by the CRISPR/Cas9 system to enhance mevalonate metabolic activity. First of all, growth inhibitory effect of (-)-α-bisabolol was tested on yeast strain because sesquiterpenoids and their derivates have antibacterial activity. As a result, the wild-type yeast cell could maintain its growth in the presence of 3 g/L of (-)-α-bisabolol when the initial OD was 1.0. Since the production of (-)-α-bisabolol may be affected by the oxygen supply and culture environment, come culture factors of glucose, agitation, medium composition, carbon sources and acidity conditions were explored for efficient (-)-α-bisabolol production. Finally, 12.5 mg/L of (-)-α-bisabolol was produced from galactose by D-M strain at the optimum culture conditions. Next, the truncated HMG1 gene expression cassette was inserted to yeast genome by CRISPR/Cas9. The resulting strain of Dt-M produced about 62.4 mg/L of (-)-α-bisabolol which was 5-fold increasement compared to D-M strain. To produce (-)-α-bisabolol more efficiently, the Dt-EM strain was constructed by introducing the ERG10 gene coding for acetoacetyl-CoA thiolase. In addition, acetyl-CoA synthase gene, which is a major gene for the biosynthesis of acetyl CoA in yeast, was further overexpressed. The resulting strain, Dt-EMA produced about 75.2 mg/L (-)-α-bisabolol from galactose in batch culture. During 72 hr fed-batch fermentation, Dt-EMA strain produced 307 mg/L (-)-α-bisabolol. The metabolic engineering strategies and optimization of fermentation in this study effectively minimized ethanol production and maximized production of target biochemicals. Especially the strategy of producing malate via glyoxylate shunt would be applicable for other organic acid production. In addition, this study presents a method for producing (-)-α-bisabolol effectively in engineered S. cerevisiae strain. This is a meaningful platform suggesting the possibility of producing various organic acids and isoprenoids using recombinant yeast strain engineered by CRISPR/Cas9 metabolic engineering tools.
Saccharomyces cerevisiae is a GRAS-microorganism widely used in various fermented foods such as traditional beer and bread. Recently, it has been recognized as a potential host strain for the bio-based functional materials production. Naturally, S. cerevisiae produces high amount of ethanol by using glucose as a substrate in the presence of oxygen as well as the absence of oxygen. Therefore, in order to produce bio-based functional material with high-efficiency, metabolic engineering of ethanol-producing pathways is required. In this study, the ADH1, GPD1, and GPD2 genes were inactivated from the yeast genome for efficient supply of pyruvic acid and acetyl-CoA to the malate synthetic pathway. Intracellular metabolite analysis revealed that metabolites related to osmotic stress were increased in D-A1G12 strain due to the removal of glycerol metabolism, and the content of citric acid was increased by a 2.94-fold compared with the strain without genetic modulation. The PYC2 gene encoding pyruvate carboxylase, the MDH3ΔSKL gene coding for malate dehydrogenase from S. cerevisiae, and the SpMAE1 gene encoding C4-dicarboxylic acid (C4-DA) transporter protein derived from Schizosaccharomyces pombe were introduced to wild-type S. cerevisiae strain for malate production. The constructed recombinant strain showed about 2.71 g/L malate production. Overexpression of the 3 genes for malate production in ADH1, GPD1 and GPD2 deficient strain resulted in 7.25 g/L malate production. In addition, the MLS1ΔSKL and ICL1 genes involved in the glyoxylate shunt were overexpressed based on the intracellular metabolite analysis results. The final S. cerevisiae strain produced 10.7 g/L of malate in a batch fermentation using 50 g/L glucose, and 21 g/L of malate production was achieved by a fed-batch culture using minimal media with 126.8 g/L glucose. (-)-α-Bisabolol is a sesquiterpene-based isoprenoid and is widely used in the manufacture of cosmetics and perfumes. In this study, (-)-α-bisabolol-producing S. cerevisiae strain of D-M was constructed by introducing MrBBS gene from German chamomile for its high production. Furthermore, truncated a HMG1 gene was overexpressed in the recombinant strain constructed by the CRISPR/Cas9 system to enhance mevalonate metabolic activity. First of all, growth inhibitory effect of (-)-α-bisabolol was tested on yeast strain because sesquiterpenoids and their derivates have antibacterial activity. As a result, the wild-type yeast cell could maintain its growth in the presence of 3 g/L of (-)-α-bisabolol when the initial OD was 1.0. Since the production of (-)-α-bisabolol may be affected by the oxygen supply and culture environment, come culture factors of glucose, agitation, medium composition, carbon sources and acidity conditions were explored for efficient (-)-α-bisabolol production. Finally, 12.5 mg/L of (-)-α-bisabolol was produced from galactose by D-M strain at the optimum culture conditions. Next, the truncated HMG1 gene expression cassette was inserted to yeast genome by CRISPR/Cas9. The resulting strain of Dt-M produced about 62.4 mg/L of (-)-α-bisabolol which was 5-fold increasement compared to D-M strain. To produce (-)-α-bisabolol more efficiently, the Dt-EM strain was constructed by introducing the ERG10 gene coding for acetoacetyl-CoA thiolase. In addition, acetyl-CoA synthase gene, which is a major gene for the biosynthesis of acetyl CoA in yeast, was further overexpressed. The resulting strain, Dt-EMA produced about 75.2 mg/L (-)-α-bisabolol from galactose in batch culture. During 72 hr fed-batch fermentation, Dt-EMA strain produced 307 mg/L (-)-α-bisabolol. The metabolic engineering strategies and optimization of fermentation in this study effectively minimized ethanol production and maximized production of target biochemicals. Especially the strategy of producing malate via glyoxylate shunt would be applicable for other organic acid production. In addition, this study presents a method for producing (-)-α-bisabolol effectively in engineered S. cerevisiae strain. This is a meaningful platform suggesting the possibility of producing various organic acids and isoprenoids using recombinant yeast strain engineered by CRISPR/Cas9 metabolic engineering tools.
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