애기장대 내에서 CYP710As 유전자는 sterol의 생합성 과정에서 desaturase로 역할을 한다고 밝혀져 있으며, 대표적으로는 STR에서 STG로의 전환에 관여한다는 것이 연구되었다. 그러나 최근에 다양한 BRs의 생합성 경로가 알려지면서 C27-BRs인 28nor-CS에서 C28-BRs인 CS로의 전환 과정이 sterol 생합성에서 일어나는 side chain의 methylation과 비슷한 방식인 desaturation, methyltransferation, reduction 과정을 거칠 것이라고 추측되었고, 이에 따라 CYP710As가 sterol 뿐만 아니라 BRs의 생합성에서도 desaturase로서의 기능을 수행할 수 있으리라는 가능성이 제시되고 있다.
현재까지 CYP710As가 BRs 생합성을 매개한다는 연구는 제대로 밝혀지지 않았기 때문에, 본 논문에서는 이를 연구하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다. CYP710As 유전자 결핍 ...
애기장대 내에서 CYP710As 유전자는 sterol의 생합성 과정에서 desaturase로 역할을 한다고 밝혀져 있으며, 대표적으로는 STR에서 STG로의 전환에 관여한다는 것이 연구되었다. 그러나 최근에 다양한 BRs의 생합성 경로가 알려지면서 C27-BRs인 28nor-CS에서 C28-BRs인 CS로의 전환 과정이 sterol 생합성에서 일어나는 side chain의 methylation과 비슷한 방식인 desaturation, methyltransferation, reduction 과정을 거칠 것이라고 추측되었고, 이에 따라 CYP710As가 sterol 뿐만 아니라 BRs의 생합성에서도 desaturase로서의 기능을 수행할 수 있으리라는 가능성이 제시되고 있다.
현재까지 CYP710As가 BRs 생합성을 매개한다는 연구는 제대로 밝혀지지 않았기 때문에, 본 논문에서는 이를 연구하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다. CYP710As 유전자 결핍 돌연변이체의 내생 sterol 분석으로 CYP710As의 결핍이 내생 sterol 함량과 비율에 어떤 영향을 주는지 확인하였고, MBP fusion protein을 이용한 in vitro enzyme assay로 BRs 생합성 과정에서의 CYP710As의 기능을 밝히고자 하였으며, 결핍 돌연변이체를 제작하여 표현형 분석을 진행하였다. 내생 sterol 분석 결과에서는 예측했던 바와 같이 CYP710As 결핍 돌연변이체에서 STR의 내생 함량이 늘어나고 STG의 내생 함량이 줄어드는 것이 확인되었다. In vitro enzyme assay에서는 우선 Escherichia coli에서 발현 및 정제한 MBP-710A1과 MBP-710A2에 28-norCS를 feeding 하여 예상되는 생성물질인 ∆24-28-norCS를 찾고자 하였으나, 해당 authentic을 보유하고 있지 않아 현재의 정제 조건으로는 이를 제대로 확인할 수 없었다. 대신에 MBP-SMT1을 함께 첨가한 후 enzyme reaction을 진행하여 28-norCS로부터 DS까지의 전환을 확인하고자 하였고, GC-SIM을 통해 생성물질인 DS를 확인하였다. Negative control인 MBP와 MBP-SMT1만을 feeding 하였을 때에는 DS가 검출되지 않은 점을 미루어 볼 때, 710As가 SMT1과 함께 28-norCS로부터 DS로의 전환을 일으키는 데에 관여한다는 것을 확인할 수 있었다. 결핍 돌연변이체를 이용한 표현형 분석에서는 CYP710A1과 CYP710A2가 결핍될 경우 식물체의 생장 속도나 생식 능력에 저하가 나타나는 것을 관찰하였고, 이는 BRs의 알려진 여러 기능과 연관이 있다고 생각된다.
추후 실험에서는 28nor-CS로부터 DS로의 전환 이전에 CYP710As에 의해 만들어지는 중간물질을 찾기 위해 다양한 조건으로 enzyme assay를 진행해보아야 한다고 판단된다. 그리고 CYP710As가 BRs의 생합성에 관여함을 확실히 밝히기 위해서는 이번 연구에서 얻어진 cyp710a1, cyp710a2, cyp710a1xcyp710a2 결핍 돌연변이를 이용하여 내생 BRs을 동정한 뒤, 실제적으로 내생 BRs의 함량에 어떤 변화가 생기는지 확인할 필요성이 있다.
애기장대 내에서 CYP710As 유전자는 sterol의 생합성 과정에서 desaturase로 역할을 한다고 밝혀져 있으며, 대표적으로는 STR에서 STG로의 전환에 관여한다는 것이 연구되었다. 그러나 최근에 다양한 BRs의 생합성 경로가 알려지면서 C27-BRs인 28nor-CS에서 C28-BRs인 CS로의 전환 과정이 sterol 생합성에서 일어나는 side chain의 methylation과 비슷한 방식인 desaturation, methyltransferation, reduction 과정을 거칠 것이라고 추측되었고, 이에 따라 CYP710As가 sterol 뿐만 아니라 BRs의 생합성에서도 desaturase로서의 기능을 수행할 수 있으리라는 가능성이 제시되고 있다.
현재까지 CYP710As가 BRs 생합성을 매개한다는 연구는 제대로 밝혀지지 않았기 때문에, 본 논문에서는 이를 연구하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다. CYP710As 유전자 결핍 돌연변이체의 내생 sterol 분석으로 CYP710As의 결핍이 내생 sterol 함량과 비율에 어떤 영향을 주는지 확인하였고, MBP fusion protein을 이용한 in vitro enzyme assay로 BRs 생합성 과정에서의 CYP710As의 기능을 밝히고자 하였으며, 결핍 돌연변이체를 제작하여 표현형 분석을 진행하였다. 내생 sterol 분석 결과에서는 예측했던 바와 같이 CYP710As 결핍 돌연변이체에서 STR의 내생 함량이 늘어나고 STG의 내생 함량이 줄어드는 것이 확인되었다. In vitro enzyme assay에서는 우선 Escherichia coli에서 발현 및 정제한 MBP-710A1과 MBP-710A2에 28-norCS를 feeding 하여 예상되는 생성물질인 ∆24-28-norCS를 찾고자 하였으나, 해당 authentic을 보유하고 있지 않아 현재의 정제 조건으로는 이를 제대로 확인할 수 없었다. 대신에 MBP-SMT1을 함께 첨가한 후 enzyme reaction을 진행하여 28-norCS로부터 DS까지의 전환을 확인하고자 하였고, GC-SIM을 통해 생성물질인 DS를 확인하였다. Negative control인 MBP와 MBP-SMT1만을 feeding 하였을 때에는 DS가 검출되지 않은 점을 미루어 볼 때, 710As가 SMT1과 함께 28-norCS로부터 DS로의 전환을 일으키는 데에 관여한다는 것을 확인할 수 있었다. 결핍 돌연변이체를 이용한 표현형 분석에서는 CYP710A1과 CYP710A2가 결핍될 경우 식물체의 생장 속도나 생식 능력에 저하가 나타나는 것을 관찰하였고, 이는 BRs의 알려진 여러 기능과 연관이 있다고 생각된다.
추후 실험에서는 28nor-CS로부터 DS로의 전환 이전에 CYP710As에 의해 만들어지는 중간물질을 찾기 위해 다양한 조건으로 enzyme assay를 진행해보아야 한다고 판단된다. 그리고 CYP710As가 BRs의 생합성에 관여함을 확실히 밝히기 위해서는 이번 연구에서 얻어진 cyp710a1, cyp710a2, cyp710a1xcyp710a2 결핍 돌연변이를 이용하여 내생 BRs을 동정한 뒤, 실제적으로 내생 BRs의 함량에 어떤 변화가 생기는지 확인할 필요성이 있다.
In Arabidopsis thaliana, the CYP710As gene has been shown to act as a sterol desaturase catalyzing conversion of STR to STG in the sterol biosynthesis. Recently, the transition from 28nor-CS (C27-BRs) to CS (C28-BRs) expected to undergo by three reactions such as desaturation, methyltransferation, a...
In Arabidopsis thaliana, the CYP710As gene has been shown to act as a sterol desaturase catalyzing conversion of STR to STG in the sterol biosynthesis. Recently, the transition from 28nor-CS (C27-BRs) to CS (C28-BRs) expected to undergo by three reactions such as desaturation, methyltransferation, and reduction was demonstrated in Arabidopsis. The desaturation of 28-norCS to ∆24-28-norCS is a similar reaction as that in conversion of STR to STG, suggesting that CYP710As can function as a BR desaturase as well as a sterol desaturase in the plant. However, involvement of CYP710As in BR biosynthesis have not been yet established.
Endogenous sterol analysis showed that CYP710As deficient mutant increased STRs and decreased STGs endogenous contents, confirming CYP710As are suitably function as a sterol desaturase. In vitro enzyme assay using MBP-710A1 and MBP-710A2 expressed in Escherichia coli, the expected enzyme product, ∆24-28-norCS could not be identified. When the enzyme reaction was performed after adding MBP-SMT1 and CYP710A1/2 together, however, the expected product DS was successfully identified by GC-SIM analysis. Considering that only the negative control MBP and MBP-SMT1 could not mediate conversion of 28-norCS to DS. 710As occur desaturation of 28-norCS to ∆24-28-norCS in methylation of 28-norCS to DS. Phenotypic analysis using CYP710A1/2 deficient mutants showed that the deficiency of CYP710A1 and CYP710A2 leads to a decrease in the growth rate and fertility of plants which is similar to those shown in BR deficient mutants. Taken together, Arabidopsis CYP710s, especially CYP710A1/2 seem to be BR desaturase which is involved in biosynthetic connection of C27-BRs to C28-BRs in Arabidopsis. To get concrete evidence for CYP710As as BR desaturases, identification of ∆24-28-norCS as an enzyme product for CYP710As and quantification of endogenous BRs using cyp710a1, cyp710a2, and cyp710a1xcyp710a2 deficiency mutations obtained in this study should be carried out in future experiments.
In Arabidopsis thaliana, the CYP710As gene has been shown to act as a sterol desaturase catalyzing conversion of STR to STG in the sterol biosynthesis. Recently, the transition from 28nor-CS (C27-BRs) to CS (C28-BRs) expected to undergo by three reactions such as desaturation, methyltransferation, and reduction was demonstrated in Arabidopsis. The desaturation of 28-norCS to ∆24-28-norCS is a similar reaction as that in conversion of STR to STG, suggesting that CYP710As can function as a BR desaturase as well as a sterol desaturase in the plant. However, involvement of CYP710As in BR biosynthesis have not been yet established.
Endogenous sterol analysis showed that CYP710As deficient mutant increased STRs and decreased STGs endogenous contents, confirming CYP710As are suitably function as a sterol desaturase. In vitro enzyme assay using MBP-710A1 and MBP-710A2 expressed in Escherichia coli, the expected enzyme product, ∆24-28-norCS could not be identified. When the enzyme reaction was performed after adding MBP-SMT1 and CYP710A1/2 together, however, the expected product DS was successfully identified by GC-SIM analysis. Considering that only the negative control MBP and MBP-SMT1 could not mediate conversion of 28-norCS to DS. 710As occur desaturation of 28-norCS to ∆24-28-norCS in methylation of 28-norCS to DS. Phenotypic analysis using CYP710A1/2 deficient mutants showed that the deficiency of CYP710A1 and CYP710A2 leads to a decrease in the growth rate and fertility of plants which is similar to those shown in BR deficient mutants. Taken together, Arabidopsis CYP710s, especially CYP710A1/2 seem to be BR desaturase which is involved in biosynthetic connection of C27-BRs to C28-BRs in Arabidopsis. To get concrete evidence for CYP710As as BR desaturases, identification of ∆24-28-norCS as an enzyme product for CYP710As and quantification of endogenous BRs using cyp710a1, cyp710a2, and cyp710a1xcyp710a2 deficiency mutations obtained in this study should be carried out in future experiments.
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