Agrobacterium 매개 Base Editing System을 이용한 Sulfonylurea 제초제 저항성 유채 개발 Developments of Sulfonylurea Herbicides-Resistant Brassica napus Using Agrobacterium-Mediated Base Editing System원문보기
유채(Brassica napus) ‘Westar’의 하배축을 재료로 하여 효율적인 Agrobacterium-매개 형질전환 조건을 선정하고, 이를 기반으로 유채 acetolactate synthase(BnALS) 유전자에 Agrobacterium을 이용한 CRISPR/nCas9 base editing을 통해 돌연변이를 유발함으로써 sulfonylurea계 제초제에 저항성을 가지는 돌연변이체를 개발하고자 연구를 수행하였다. 배축 절편체의 접종 전 전처리 기간과 접종 후 선발제의 종류 및 농도를 달리하여 배양하였으며, 각각의 조건에 따른 유전자 도입 효율을 ...
유채(Brassica napus) ‘Westar’의 하배축을 재료로 하여 효율적인 Agrobacterium-매개 형질전환 조건을 선정하고, 이를 기반으로 유채 acetolactate synthase(BnALS) 유전자에 Agrobacterium을 이용한 CRISPR/nCas9 base editing을 통해 돌연변이를 유발함으로써 sulfonylurea계 제초제에 저항성을 가지는 돌연변이체를 개발하고자 연구를 수행하였다. 배축 절편체의 접종 전 전처리 기간과 접종 후 선발제의 종류 및 농도를 달리하여 배양하였으며, 각각의 조건에 따른 유전자 도입 효율을 GUS 조직화학적 분석을 통해 비교하였다. 전처리 0일과 3일 처리구에서 GUS 발현율은 각각 84.8%, 8.4%이었으며, 전처리 0일 처리가 유전자 도입에 훨씬 효과적이라는 것을 알 수 있었다. 선발제인 phosphinothricin(PPT)과 kanamycin(Km)을 비교하였을 때 PPT가 GUS 유전자 발현에 높은 효율을 보였다. 이로 보아 전처리 없이 형질전환을 실시하고 PPT 선발을 하는 것이 유채 ‘Westar’ 품종에 효율적인 Agrobacterium-매개 형질전환 조건이라고 판단된다. 이를 기반으로 유채 ALS(BnALS)의 Pro 173을 표적으로 하는 19 nucleotide의 sgRNA가 삽입된 cytidine base-editing vector pECO201_CDA1_BnALS19를 Agrobacterium-매개 형질전환을 통해 유채 배축 절편체로 도입하였으며, 형질전환된 배축 절편체를 PPT 5.0 mg/L를 첨가한 선발 배지에서 배양하였다. 선발배지에서 5계통의 신초가 재생되었으며, 선발마커 유전자인 bar와 nCas9 유전자에 specific한 primer를 이용한 PCR 분석을 통해 base editing system이 안정적으로 도입되어있는 4계통의 형질전환 신초를 선발하였다. Sanger sequencing을 이용한 돌연변이 패턴 분석을 통해 4계통 모두 protospacer의 C6에 공통적으로 염기 치환이 발생한 것을 알 수 있었다. 이 가운데 1계통은 C7 위치에 C-T 치환이 일어나 ALS의 173번째 아미노산이 proline에서 serine으로 바뀐 P173S mutant라는 것을 확인하였으며, P173S mutant ALS를 가지는 이 mutant는 sulfonylurea계 제초제에 저항성을 보일 것으로 생각된다. 결론적으로 본 연구를 통해 유채 ‘Westar’ 품종에서 효과적인 Agrobacterium-매개 형질전환 조건을 제시하였으며, Agrobacterium-매개 형질전환을 이용한 CRISPR/nCas9 base editor를 통해 base editing이 이루어졌음을 확인하였고 sulfonylurea계 제초제 저항성변이체 생산 가능성을 제시하였다.
유채(Brassica napus) ‘Westar’의 하배축을 재료로 하여 효율적인 Agrobacterium-매개 형질전환 조건을 선정하고, 이를 기반으로 유채 acetolactate synthase(BnALS) 유전자에 Agrobacterium을 이용한 CRISPR/nCas9 base editing을 통해 돌연변이를 유발함으로써 sulfonylurea계 제초제에 저항성을 가지는 돌연변이체를 개발하고자 연구를 수행하였다. 배축 절편체의 접종 전 전처리 기간과 접종 후 선발제의 종류 및 농도를 달리하여 배양하였으며, 각각의 조건에 따른 유전자 도입 효율을 GUS 조직화학적 분석을 통해 비교하였다. 전처리 0일과 3일 처리구에서 GUS 발현율은 각각 84.8%, 8.4%이었으며, 전처리 0일 처리가 유전자 도입에 훨씬 효과적이라는 것을 알 수 있었다. 선발제인 phosphinothricin(PPT)과 kanamycin(Km)을 비교하였을 때 PPT가 GUS 유전자 발현에 높은 효율을 보였다. 이로 보아 전처리 없이 형질전환을 실시하고 PPT 선발을 하는 것이 유채 ‘Westar’ 품종에 효율적인 Agrobacterium-매개 형질전환 조건이라고 판단된다. 이를 기반으로 유채 ALS(BnALS)의 Pro 173을 표적으로 하는 19 nucleotide의 sgRNA가 삽입된 cytidine base-editing vector pECO201_CDA1_BnALS19를 Agrobacterium-매개 형질전환을 통해 유채 배축 절편체로 도입하였으며, 형질전환된 배축 절편체를 PPT 5.0 mg/L를 첨가한 선발 배지에서 배양하였다. 선발배지에서 5계통의 신초가 재생되었으며, 선발마커 유전자인 bar와 nCas9 유전자에 specific한 primer를 이용한 PCR 분석을 통해 base editing system이 안정적으로 도입되어있는 4계통의 형질전환 신초를 선발하였다. Sanger sequencing을 이용한 돌연변이 패턴 분석을 통해 4계통 모두 protospacer의 C6에 공통적으로 염기 치환이 발생한 것을 알 수 있었다. 이 가운데 1계통은 C7 위치에 C-T 치환이 일어나 ALS의 173번째 아미노산이 proline에서 serine으로 바뀐 P173S mutant라는 것을 확인하였으며, P173S mutant ALS를 가지는 이 mutant는 sulfonylurea계 제초제에 저항성을 보일 것으로 생각된다. 결론적으로 본 연구를 통해 유채 ‘Westar’ 품종에서 효과적인 Agrobacterium-매개 형질전환 조건을 제시하였으며, Agrobacterium-매개 형질전환을 이용한 CRISPR/nCas9 base editor를 통해 base editing이 이루어졌음을 확인하였고 sulfonylurea계 제초제 저항성 변이체 생산 가능성을 제시하였다.
This study was conducted to figure out the efficient Agrobacterium- mediated transformation conditions using hypocotyl explants and to develop mutants resistant to sulfonylurea herbicides by inducing mutation in the acetolactate synthase (ALS) gene through Agrobacterium-mediated CRISPR/nCas9 base ed...
This study was conducted to figure out the efficient Agrobacterium- mediated transformation conditions using hypocotyl explants and to develop mutants resistant to sulfonylurea herbicides by inducing mutation in the acetolactate synthase (ALS) gene through Agrobacterium-mediated CRISPR/nCas9 base editing in Brassica napus ‘Westar’. In Agrobacterium- mediated transformation, the preculture period of hypocotyl explants before bacterial inoculation and the type and concentration of selection agents after inoculation were treated differently and the gene introduction efficiencies were compared through GUS histochemical analysis. It was confirmed that the preculture period had a great influence on gene introduction efficiency. In preculture 0 and 3 days, GUS expression rates were 84.8% and 8.4%, respectively. Preculture 0 day treatment was much more effective in gene introduction. In the comparison of the selection agents, phosphinothricin (PPT) and kanamycin (Km), high efficiency in GUS gene expression was obtained in the explants cultured in PPT containing medium. As a result, for the efficient Agrobacterium-mediated transformation of Brassica napus ‘Westar’, the explants should be inoculated without preculture and cultured on selection medium containing PPT. Based on this, CRISPR/nCas9 base editing vector pECO201_CDA1_BnALS19 containing 19 nucleotide sgRNA targeting Pro 173 of Brassica napus ALS gene was introduced into hypocotyl explants through Agrobacterium-mediated transformation and the transformed explants were cultured in a selection medium containing 5.0 mg/L PPT. After the culture and selection process, 5 lines of shoots were generated. PCR analysis using primers specific to each of the bar and nCas9 genes showed that the base editing system was stably integrated into 4 lines of transgenic shoots. The mutation patterns were assayed after Sanger sequencing, and base substitution(s) occurred in common at C6 of the protospacer in all four lines. One line had C-T substitution at the C6 and C7 positions, caused a change in the amino acid sequence from proline to serine (P173F). The base-edited mutants with P173S mutation of ALS are thought to show resistance to sulfonylurea herbicides. Conclusively, Agrobacterium-mediated transformation conditions were optimized and base-edited transgenics were produced using CRISPR/nCas9 base editor through Agrobacterium-mediated transformation in Brassica napus 'Westar'.
This study was conducted to figure out the efficient Agrobacterium- mediated transformation conditions using hypocotyl explants and to develop mutants resistant to sulfonylurea herbicides by inducing mutation in the acetolactate synthase (ALS) gene through Agrobacterium-mediated CRISPR/nCas9 base editing in Brassica napus ‘Westar’. In Agrobacterium- mediated transformation, the preculture period of hypocotyl explants before bacterial inoculation and the type and concentration of selection agents after inoculation were treated differently and the gene introduction efficiencies were compared through GUS histochemical analysis. It was confirmed that the preculture period had a great influence on gene introduction efficiency. In preculture 0 and 3 days, GUS expression rates were 84.8% and 8.4%, respectively. Preculture 0 day treatment was much more effective in gene introduction. In the comparison of the selection agents, phosphinothricin (PPT) and kanamycin (Km), high efficiency in GUS gene expression was obtained in the explants cultured in PPT containing medium. As a result, for the efficient Agrobacterium-mediated transformation of Brassica napus ‘Westar’, the explants should be inoculated without preculture and cultured on selection medium containing PPT. Based on this, CRISPR/nCas9 base editing vector pECO201_CDA1_BnALS19 containing 19 nucleotide sgRNA targeting Pro 173 of Brassica napus ALS gene was introduced into hypocotyl explants through Agrobacterium-mediated transformation and the transformed explants were cultured in a selection medium containing 5.0 mg/L PPT. After the culture and selection process, 5 lines of shoots were generated. PCR analysis using primers specific to each of the bar and nCas9 genes showed that the base editing system was stably integrated into 4 lines of transgenic shoots. The mutation patterns were assayed after Sanger sequencing, and base substitution(s) occurred in common at C6 of the protospacer in all four lines. One line had C-T substitution at the C6 and C7 positions, caused a change in the amino acid sequence from proline to serine (P173F). The base-edited mutants with P173S mutation of ALS are thought to show resistance to sulfonylurea herbicides. Conclusively, Agrobacterium-mediated transformation conditions were optimized and base-edited transgenics were produced using CRISPR/nCas9 base editor through Agrobacterium-mediated transformation in Brassica napus 'Westar'.
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