QuEChERS법을 활용한 농산물 중 제초제 Tolpyralate의 최적 분석법 선발 및 검증 Application and Validation of an Optimal Analytical Method using QuEChERS for the determination of Tolpyralate in Agricultural Products원문보기
BACKGROUND: Pesticides are broadly used to control weeds and pests, and the residues remaining in crops are managed in accordance with the MRLs (maximum residue limits). Therefore, an analytical method is required to quantify the residues, and we conducted a series of analyses to select and validate...
BACKGROUND: Pesticides are broadly used to control weeds and pests, and the residues remaining in crops are managed in accordance with the MRLs (maximum residue limits). Therefore, an analytical method is required to quantify the residues, and we conducted a series of analyses to select and validate the quick and simple analytical method for tolpyralate in five agricultural products using QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) method and LC-MS/MS (liquid chromatography-tandem mass spectrometry). METHODS AND RESULTS: The agricultural samples were extracted with acetonitrile followed by addition of anhydrous magnesium sulfate, sodium chloride, disodium hydrogencitrate sesquihydrate and trisodium citrate dihydrate. After shaking and centrifugation, purification was performed with d-SPE (dispersive-solid phase extraction) sorbents. To validate the optimized method, its selectivity, linearity, LOD (limit of detection), LOQ (limit of quantitation), accuracy, repeatability, and reproducibility from the inter-laboratory analyses were considered. LOQ of the analytical method was 0.01 mg/kg at five agricultural products and the linearity of matrix-matched calibration were good at seven concentration levels, from 0.0025 to 0.25 mg/L (R2≥0.9980). Mean recoveries at three spiking levels (n=5) were in the range of 85.2~112.4% with associated relative standard deviation values less than 6.2%, and the coefficient of variation between the two laboratories was also below 13%. All optimized results were validated according to the criteria ranges requested in the Codex Alimentarius Commission (CAC) and Ministry of Food and Drug Safety (MFDS) guidelines. CONCLUSION: In conclusion, we suggest that the selected and validated method could serve as a basic data for detecting tolpyralate residue in imported and domestic agricultural products.
BACKGROUND: Pesticides are broadly used to control weeds and pests, and the residues remaining in crops are managed in accordance with the MRLs (maximum residue limits). Therefore, an analytical method is required to quantify the residues, and we conducted a series of analyses to select and validate the quick and simple analytical method for tolpyralate in five agricultural products using QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) method and LC-MS/MS (liquid chromatography-tandem mass spectrometry). METHODS AND RESULTS: The agricultural samples were extracted with acetonitrile followed by addition of anhydrous magnesium sulfate, sodium chloride, disodium hydrogencitrate sesquihydrate and trisodium citrate dihydrate. After shaking and centrifugation, purification was performed with d-SPE (dispersive-solid phase extraction) sorbents. To validate the optimized method, its selectivity, linearity, LOD (limit of detection), LOQ (limit of quantitation), accuracy, repeatability, and reproducibility from the inter-laboratory analyses were considered. LOQ of the analytical method was 0.01 mg/kg at five agricultural products and the linearity of matrix-matched calibration were good at seven concentration levels, from 0.0025 to 0.25 mg/L (R2≥0.9980). Mean recoveries at three spiking levels (n=5) were in the range of 85.2~112.4% with associated relative standard deviation values less than 6.2%, and the coefficient of variation between the two laboratories was also below 13%. All optimized results were validated according to the criteria ranges requested in the Codex Alimentarius Commission (CAC) and Ministry of Food and Drug Safety (MFDS) guidelines. CONCLUSION: In conclusion, we suggest that the selected and validated method could serve as a basic data for detecting tolpyralate residue in imported and domestic agricultural products.
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문제 정의
또한 다성분 분석 뿐만 아니라 식물 또는 동물의 체내에서 생성되는 대사산물을 동시 분석하는 데 응용이 가능한 장점이 있다[9, 10]. 따라서 본 연구에서는 tolpyralate의 잔류량 검사에 필요한 공정 시험법으로 QuEChERS법을 이용하여 현미(곡류), 감자(서류), 대두(두류), 감귤(과일류) 및 고추(채소류) 등 5종 모두에 적용할 수 있도록 개발하고 국내의 잔류허용기준 설정을 위한 기초자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
Tolpyralate는 Waters사의 MS/MS (Xevo TQ-S, Milford, MA, USA)를 장착한 LC (Acquity UPLC, Milford, MA, USA)로 분석하였고, 내경이 2 mm이며 길이가 50 mm인 C18 column을 이용하였다. 이동상 A와 B에 각각 0.
01 mg/kg 수준을 확보 할 수 있는 고감도의 검출기가 장착된 LC-MS/MS를 분석기기로 선정하였다. Tolpyralate의 분리를 위해 컬럼은 입자크기가 3.0 μm인 C18 역상컬럼을 선택하였고, 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴과 0.1% 포름산 함유 물을 이동상으로 하여 gradient 방식으로 분석하였다.
5분까지 20%로 내린 후 7분까지 초기 조건을 유지하였다. 농산물 시료 중 tolpyralate의 정량 및 정성적 확인을 위하여 MS/MS의 ESI (electrospray ionization) positive mode 로 정량이온 및 정성이온을 선택한 후 최적의 cone voltage 및 collision energy 값을 선정하였다. MS/MS의 capillary voltage는 1 kV이며 source 및 desolvation 온도는 각각 150℃와 500℃이었다.
01법으로 현미를 추출할 경우 그 영향이 더 큼을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 QuEChERS EN 15662법을 이용한 추출과 MgSO4 및 PSA, C18, GCB를 이용한 d-SPE 정제 방법을 적용하여 tolpyralate 시험법을 최적화 하였다.
전자분무이온화법(electrospray ionization; ESI)의 positiveion mode에서 1 μg/mL 수준의 tolpyralate 표준용액을 5 μL/min의 일정한 속도로 질량분석기에 직접 주입하고 mass spectrum을 통해 생성이온(product ion)과 선구이온(precursor ion)을 확인한 후, 분석의 선택성과 검출강도를 극대화하기 위하여 최적의 cone voltage 및 collision energy를 선정하였다. 우선 생성이온을 확인하기 위하여 100~600 m/z의 범위로 mass scan을 수행하였고 exact mass가 484.
확립된 시험법의 유효성을 검증하기 위하여 선택성, 직선성, 기기상 검출한계(limit of detection; LOD)와 정량한계(limit of quantitation; LOQ), 시험법 정량한계(method limit of quantitation; MLOQ), 정확성 및 반복성, 재현성을 검증 하였다. 선택성은 무처리 시료와 표준용액을 첨가한 회수율 시료를 확립된 전처리 시험법으로 조제한 후 각각의 크로마토그램을 서로 비교하고, 직선성은 무처리 용액으로 희석한 표준검량선 용액을 5 μL씩 주입하고 얻어진 피크의 면적값으로 검량선을 작성하여 결정계수(correlation coefficient, R2)를 구하였다.
대상 데이터
Tolpyralate 표준품(99.9%)은 원제회사인 ISK바이오사이언스코리아(주)에서 제공받아 사용하였으며, 아세토니트릴(acetonitrile)은 HPLC grade를 Merck (Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 사용하였다. 전처리 중 사용된 QuEChERS 추출 시약 키트(Part No.
2 μm × 13 mm)는 Teknokroma (Barcelona, Spain)로부터 구입하였다. 시험법 대상 작물인 현미, 감자, 대두, 감귤 및 고추는 각각 식품의약품안전처에서 정한 곡류, 서류, 두류, 과일류 및 채소류의 대표농산물에 해당하며 모두 무농약 농산물을 구입하였다. 현미와 대두는 약 1 kg을 혼합하여 표준체 420 μm를 통과하도록 분쇄하고 감자와 감귤, 고추는 약 1 kg을 분쇄하여 균질화한 후 폴리에틸렌 지퍼백에 담아 –20℃ 이하에서 냉동보관 하였다.
데이터처리
01법과 British Standards Institution (BSI)에서 개발한 EN 15662법은 pH에 민감한 대상성분을 추출하기 위하여 추출 과정에 acetate 또는 citrate buffer를 사용한다. 본 연구에서는 buffer를 쓰지 않는 original법과 두 가지 buffer를 이용한 QuEChERS법을 비교 실험하였다. Original법은 아세토니트릴로 추출 후 무수황산마그네슘 6 g과 염화나트륨 1.
확립된 시험법의 유효성을 검증하기 위하여 선택성, 직선성, 기기상 검출한계(limit of detection; LOD)와 정량한계(limit of quantitation; LOQ), 시험법 정량한계(method limit of quantitation; MLOQ), 정확성 및 반복성, 재현성을 검증 하였다. 선택성은 무처리 시료와 표준용액을 첨가한 회수율 시료를 확립된 전처리 시험법으로 조제한 후 각각의 크로마토그램을 서로 비교하고, 직선성은 무처리 용액으로 희석한 표준검량선 용액을 5 μL씩 주입하고 얻어진 피크의 면적값으로 검량선을 작성하여 결정계수(correlation coefficient, R2)를 구하였다. 또한 기기상 검출한계와 정량한계는 크로마토그램상에서 검출된 피크의 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio, S/N)가 각각 3 이상과 10 이상을 나타내는 성분의 농도를 의미하며, 시험법 정량한계는 기기상 정량한계와 시료량 및 추출용매량을 이용하여 산출하였다.
또한 기기상 검출한계와 정량한계는 크로마토그램상에서 검출된 피크의 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio, S/N)가 각각 3 이상과 10 이상을 나타내는 성분의 농도를 의미하며, 시험법 정량한계는 기기상 정량한계와 시료량 및 추출용매량을 이용하여 산출하였다. 시험법의 정확성 및 반복성은 5종 농산물 시료 5 g에 시험법 정량한계, 정량한계 10배 및 50배 농도에 해당되는 수준인 0.25, 2.5 및 12.5 ppm의 표준용액 200 μL를 처리하여 분석한 후 5반복 실험의 회수율(recovery) 평균과 상대표준편차(relative standard deviation; RSD)를 구하여 평가하였다. 재현성은 외부기관과 실험실간 검증(inter-laboratory validation)을 실시하고 변이계수(coefficient of variance; CV)를 구하여 확인하였다.
5 ppm의 표준용액 200 μL를 처리하여 분석한 후 5반복 실험의 회수율(recovery) 평균과 상대표준편차(relative standard deviation; RSD)를 구하여 평가하였다. 재현성은 외부기관과 실험실간 검증(inter-laboratory validation)을 실시하고 변이계수(coefficient of variance; CV)를 구하여 확인하였다.
이론/모형
시험법의 재현성을 검증하기 위해 외부 식품위생검사기관인 서울지방식품의약품안전청에 시험법을 제공하여 동일한 방법으로 분석을 수행하였다. 검증기관이 수행한 3반복 회수율 시험의 회수율 및 표준편차를 구하여 가이드라인에 따른 재현성을 평가하였으며, 검증 결과 검증기관의 각 농도별 tolpyralate의 평균 회수율은 76.
성능/효과
하지만 GCB는 thiabendazole, cyprodinil 등과 같은 평면 구조를 가진 농약 성분을 흡착시켜 회수율이 저하되는 결과를 초래하기도 한다[6, 11]. 5종의 농산물 시료에 정량한계 10배의 농도에 해당되는 2.5 ppm 표준용액 200 μL를 처리하여 세 가지 QuEChERS법으로 추출 및 정제 실험을 한 결과, 모든 시험구에서의 회수율이 Codex 가이드라인의 잔류농약 분석 기준 및 식품의약품안전평가원의 식품 등 시험법 마련 표준절차에 관한 가이드라인에 적합하였으며 차이가 크게 나타나지 않았다(Table 2). 하지만 현미 시료의 경우 회수율의 표준편차가 크게 나타났는데 이와 같은 결과로 matrix의 종류에 따라 회수율이 영향을 받고 있으며 AOAC Official 2007.
01 mg/kg에 부합하였다. 각각의 농산물 무처리 시료에 0.01, 0.1 및 0.5 mg/kg의 수준이 되도록 tolpyralate를 처리하여 5반복 회수율 실험을 한 결과 평균 회수율은 85.2~112.4%이었고, 상대표준 편차는 6.2% 이하로 조사되었다. 위의 결과에 따라 본 시험법의 정확성 및 반복성은 Codex 가이드라인 및 식품의약품안전평가원의 가이드라인에 따른 시험법 검증 기준에 적합함을 확인할 수 있었다(Table 3).
시험법의 재현성을 검증하기 위해 외부 식품위생검사기관인 서울지방식품의약품안전청에 시험법을 제공하여 동일한 방법으로 분석을 수행하였다. 검증기관이 수행한 3반복 회수율 시험의 회수율 및 표준편차를 구하여 가이드라인에 따른 재현성을 평가하였으며, 검증 결과 검증기관의 각 농도별 tolpyralate의 평균 회수율은 76.1~113.7%이었고 상대표준편차는 8.7% 이하로 조사되었다. 또한 두 실험실간 회수율 결과에 따른 평균값은 86.
7% 이하로 조사되었다. 또한 두 실험실간 회수율 결과에 따른 평균값은 86.1~107.5%이며 변이계수는 처리농도 0.01 mg/kg에서 11.3% 이하, 0.1 mg/kg에서 12.4% 이하, 0.5 mg/kg에서 11.9% 이하로 모든 처리군에서 Codex 가이드라인 및 식품의약품안전평가원의 가이드라인이 제시한 처리 농도 별 기준보다 낮아 적합한 것으로 확인되었다(Table 3).
본 연구에서 무처리 농산물 시료의 LC-MS/MS 크로마토그램을 확인한 결과 tolpyralate의 머무름 시간(retention time; RT)인 3.5분에 어떠한 간섭물질도 검출되지 않아 확립된 시험법이 높은 분리능과 선택성을 가짐을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
2% 이하로 조사되었다. 위의 결과에 따라 본 시험법의 정확성 및 반복성은 Codex 가이드라인 및 식품의약품안전평가원의 가이드라인에 따른 시험법 검증 기준에 적합함을 확인할 수 있었다(Table 3).
후속연구
01 mg/kg 이하가 검출되어야 한다. 그러므로 농산물 유통 시 잔류허용기준의 부적합률을 낮추기 위하여 다양한 농산물에 잔류허용기준을 설정하고, 설정과 동시에 잔류하는 tolpyralate를 분석할 수 있는 신속, 간편한 공정시험법이 마련되어야 한다.
전처리 과정에서 유채씨는 오일 함량이 많아 아세톤과 물을 80:20(v/v)으로 혼합하여 추출하였고 그 외 작물은 아세토니트릴과 물을 80:20(v/v)으로 혼합하여 추출하였으며, 정제는 HLB (hydrophilic-lipophilic balance) 카트리지를 이용하였다. 대상 작물의 전체 회수율은 71~105%였으며 시험법 정량한계도 0.01 mg/kg으로 가이드라인에 만족할만한 수준이었지만, 국내 재배 작물과 수입 농산물에 대한 tolpyralate의 잔류량 검사에 따라 분석대상 품목을 확대 적용한 시험법이 필요할 뿐만 아니라 단시간에 여러 시료를 검사할 수 있는 간단한 과정의 시험법 개발이 필요하다. QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)법은 2003년 Anastassiades에 의해 개발되어 농산물 및 축산물 등 여러 가지 시료를 대상으로 전 세계적으로 연구되고 있는 분석법으로 실험절차가 간단하고 대상 성분의 특성에 따라 다양 하게 변경하여 적용할 수 있는 폭이 넓다[6-8].
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
4-HPPD은 어떤 특징이 있는가?
에서 개발한 benzoylpyrazole계 약제로 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (4-HPPD) 효소 활성을 억제하여 옥수수 재배 시 발생하는 일년생 잡초와 광엽 잡초를 방제하는 발아후 제초제이다. 4-HPPD는 아미노산인 티로신(tyrosine)을 분해하여 광합성에서 전자전달에 관여하는 플라스토퀴논(plastoquinone)과 비타민E의 작용을 갖는 천연물질인 토코페롤(tocopherol) 등을 합성한다. 따라서 4-HPPD의 활성 억제는 간접적으로 카로티노이드(carotenoid) 생합성 경로의 PDS (phytoene desaturase step) 효소에 영향을 주어 카로틴 형성이 억제되고 엽록소인 클로로필(chlorophyll)의 붕괴가 일어나 신엽의 백화(whitening)현상을 보이며 수일 내에 식물체를 고사시킨다[1-3].
Tolpyralate는 무엇인가?
Tolpyralate ((RS)-1-{1-ethyl-4-[4-mesyl-3-(2-methoxyethoxy)-o-toluoyl] pyrazol-5-yloxy}ethyl methyl carbonate)는 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.에서 개발한 benzoylpyrazole계 약제로 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (4-HPPD) 효소 활성을 억제하여 옥수수 재배 시 발생하는 일년생 잡초와 광엽 잡초를 방제하는 발아후 제초제이다. 4-HPPD는 아미노산인 티로신(tyrosine)을 분해하여 광합성에서 전자전달에 관여하는 플라스토퀴논(plastoquinone)과 비타민E의 작용을 갖는 천연물질인 토코페롤(tocopherol) 등을 합성한다.
QuEChERS법을 이용하면 어떤 장점이 있는가?
QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)법은 2003년 Anastassiades에 의해 개발되어 농산물 및 축산물 등 여러 가지 시료를 대상으로 전 세계적으로 연구되고 있는 분석법으로 실험절차가 간단하고 대상 성분의 특성에 따라 다양 하게 변경하여 적용할 수 있는 폭이 넓다[6-8]. 또한 다성분 분석 뿐만 아니라 식물 또는 동물의 체내에서 생성되는 대사산물을 동시 분석하는 데 응용이 가능한 장점이 있다[9, 10]. 따라서 본 연구에서는 tolpyralate의 잔류량 검사에 필요한 공정 시험법으로 QuEChERS법을 이용하여 현미(곡류), 감자(서류), 대두(두류), 감귤(과일류) 및 고추(채소류) 등 5종 모두에 적용할 수 있도록 개발하고 국내의 잔류허용기준 설정을 위한 기초자료로 활용하고자 하였다.
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