성의 분화는 생명의 진화 과정에서 가장 다양한 유전자의 출현을 촉진한 시발점으로 종의 생존에 결정적인 영향을 미치는 유성생식의 양상을 결정한다. 홍조식물 Bostrychia moritziana의 성 분화 과정을 밝히기 위하여 유성생식 생활사 중 나타나는 수배우체, 암배우체 및 사분포자체에 대하여 High-throughput sequencing을 수행하여 총 30 Gb의 대용량 발현유전체를 확보하고 RNAseq데이터 분석을 수행하였다. 발현유전체 분석을 통해 성 특이적인 19개의 유전자 (수배우체 Bms1-10, 암배우체 Bfs1-9)를 선별하였다. 대부분의 성 특이적 유전자는 ...
성의 분화는 생명의 진화 과정에서 가장 다양한 유전자의 출현을 촉진한 시발점으로 종의 생존에 결정적인 영향을 미치는 유성생식의 양상을 결정한다. 홍조식물 Bostrychia moritziana의 성 분화 과정을 밝히기 위하여 유성생식 생활사 중 나타나는 수배우체, 암배우체 및 사분포자체에 대하여 High-throughput sequencing을 수행하여 총 30 Gb의 대용량 발현유전체를 확보하고 RNAseq데이터 분석을 수행하였다. 발현유전체 분석을 통해 성 특이적인 19개의 유전자 (수배우체 Bms1-10, 암배우체 Bfs1-9)를 선별하였다. 대부분의 성 특이적 유전자는 세포분열, 신호전달 경로, 염색체 분리, 핵 세포질 단백질 이동 또는 tRNA 변형을 포함한 다양한 유전자 조절 단계에 관여함으로 나타났다. 수배우체와 암배우체에서 importin alpha 유전자와 PreQ(0) reductase는 상동체 사이의 아미노산 서열 동일성은 각각 75 % 및 74 %로 낮은 유사도를 나타내었다. 이러한 상동체가 각각의 성별에서 비 재조합 UV 유형 염색체에 있음으로 사료된다. 성적으로 우세하게 발현하지만, 성 특이적이지 않은 39개의 성 편향 유전자 (수배우체 Bmde1-25, 암배우체 Bfde1-14)를 발견하였고, 이 중 19개 유전자는 전이성 유전인자(transposable element)로 나타났다. 이를 종합하면 B. moritziana의 성적 분화는 한 성별에만 존재하는 성 특이적 유전자와 성 편향 유전자의 차등 발현 모두에서 세포 과정의 다단계 조절에 의해 달성 될 수 있음으로 사료된다. 홍조식물의 수정은 생명주기에 가장 중요한 사건이다. 홍조식물 B. moritziana는 수배우체의 많은 부동정자 (sperm)와 암배우체의 수정모 사이에서 동시에 다정자 회피 현상을 겪는다. B. moritziana의 수정 과정 및 세포 골격의 메커니즘을 밝히기 위하여 time-lapse videography (1 frame/3 sec) 및 형광 프로브를 사용하여 세포질 융합 (plasmogamy) 후 수정모에서 정자 핵 및 세포 소기관의 움직임을 추적하였다. B. moritziana의 수정 과정은 5 개의 독특한 단계로 1) 배우자-배우자 결합; 2) 부착 된 정자의 유사 분열; 3) 수정관의 형성; 4) 정자의 핵이 수정관을 통해 태원열로 이동; 및 5) 배우자 핵 사이의 핵융합 후 세포의 나머지 부분으로부터 수정모의 세포질 절단으로 구성되었다. 수정모에 들어간 첫 번째 핵이 태원열 기저로 빠르게 이동하여, 암배우체 핵과 융합하는 것을 확인하였다. 다른 정자의 핵은 첫 번째 핵이 태원열에 들어간 직후 방향 운동을 멈추고 수정모에 들어간 곳 근처에서 진동하였다. 배우체 융합 후, 수정모가 파열되거나 수정모 내부에서 큰 액포의 증가와 수정모 세포질 내의 움직임이 차단되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 B. moritziana에서 다정자 회피 현상이 수정모에 들어간 첫 번째 핵만이 선택적이고 신속한 수송 메커니즘을 확인하였고, 배우체간 세포핵융합 후 수정모의 파열 혹은 액포생성에 의해 달성되었음으로 사료된다. 홍조식물의 수정은 ROS (Reactive oxygen species) 유발 세포 과정을 연구하는 흥미로운 모델을 제공한다. B. moritziana에서 과산화수소 (H2O2) 신호가 배우자 결합, 정자 유사 분열 및 접합체의 발달을 포함한 수정의 중요한 단계에 관여한다는 것을 확인하였다. DAB 염색을 통해, 과산화수소의 축적이 정자의 표면에서 시작되어 정자와 수정모 사이의 수정관이 발달했을 때, 수정관에서 과산화수소의 축적이 관찰되었다. 이후 암배우체의 태원열까지 점차적으로 추적됨을 확인하였다. 과산화수소의 생성을 매개하는 NADPH-oxidase는 전사체 데이터베이스를 사용하여, 세개의 상동체 (Bmrboh1-3)를 확인하였다. qPCR를 통해, 배우체 결합 후 10-30 분 사이에 암배우체에서 , Bmrboh1-3유전자의 발현이 높게 발현됨을 확인하였다. NADPH-oxidase경로가 DPI에 의해 억제되었을 때, 수정의 진행이 중단되었다. 항산화제 또는 DPI처리 시 정자의 유사분열은 관찰되지 않았다. 이후 과산화수소의 외부 공급으로, DPI 전 처리된 정자에서 유사분열이 부분적으로 회복됨을 확인하였다. 위의 결과는 과산화수소가 수정 과정에 결정적인 영향을 미치는 신호 분자이며, 수정의 진행과 수정 후 발달에 필수적이라고 사료된다.
성의 분화는 생명의 진화 과정에서 가장 다양한 유전자의 출현을 촉진한 시발점으로 종의 생존에 결정적인 영향을 미치는 유성생식의 양상을 결정한다. 홍조식물 Bostrychia moritziana의 성 분화 과정을 밝히기 위하여 유성생식 생활사 중 나타나는 수배우체, 암배우체 및 사분포자체에 대하여 High-throughput sequencing을 수행하여 총 30 Gb의 대용량 발현유전체를 확보하고 RNAseq데이터 분석을 수행하였다. 발현유전체 분석을 통해 성 특이적인 19개의 유전자 (수배우체 Bms1-10, 암배우체 Bfs1-9)를 선별하였다. 대부분의 성 특이적 유전자는 세포분열, 신호전달 경로, 염색체 분리, 핵 세포질 단백질 이동 또는 tRNA 변형을 포함한 다양한 유전자 조절 단계에 관여함으로 나타났다. 수배우체와 암배우체에서 importin alpha 유전자와 PreQ(0) reductase는 상동체 사이의 아미노산 서열 동일성은 각각 75 % 및 74 %로 낮은 유사도를 나타내었다. 이러한 상동체가 각각의 성별에서 비 재조합 UV 유형 염색체에 있음으로 사료된다. 성적으로 우세하게 발현하지만, 성 특이적이지 않은 39개의 성 편향 유전자 (수배우체 Bmde1-25, 암배우체 Bfde1-14)를 발견하였고, 이 중 19개 유전자는 전이성 유전인자(transposable element)로 나타났다. 이를 종합하면 B. moritziana의 성적 분화는 한 성별에만 존재하는 성 특이적 유전자와 성 편향 유전자의 차등 발현 모두에서 세포 과정의 다단계 조절에 의해 달성 될 수 있음으로 사료된다. 홍조식물의 수정은 생명주기에 가장 중요한 사건이다. 홍조식물 B. moritziana는 수배우체의 많은 부동정자 (sperm)와 암배우체의 수정모 사이에서 동시에 다정자 회피 현상을 겪는다. B. moritziana의 수정 과정 및 세포 골격의 메커니즘을 밝히기 위하여 time-lapse videography (1 frame/3 sec) 및 형광 프로브를 사용하여 세포질 융합 (plasmogamy) 후 수정모에서 정자 핵 및 세포 소기관의 움직임을 추적하였다. B. moritziana의 수정 과정은 5 개의 독특한 단계로 1) 배우자-배우자 결합; 2) 부착 된 정자의 유사 분열; 3) 수정관의 형성; 4) 정자의 핵이 수정관을 통해 태원열로 이동; 및 5) 배우자 핵 사이의 핵융합 후 세포의 나머지 부분으로부터 수정모의 세포질 절단으로 구성되었다. 수정모에 들어간 첫 번째 핵이 태원열 기저로 빠르게 이동하여, 암배우체 핵과 융합하는 것을 확인하였다. 다른 정자의 핵은 첫 번째 핵이 태원열에 들어간 직후 방향 운동을 멈추고 수정모에 들어간 곳 근처에서 진동하였다. 배우체 융합 후, 수정모가 파열되거나 수정모 내부에서 큰 액포의 증가와 수정모 세포질 내의 움직임이 차단되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 B. moritziana에서 다정자 회피 현상이 수정모에 들어간 첫 번째 핵만이 선택적이고 신속한 수송 메커니즘을 확인하였고, 배우체간 세포핵융합 후 수정모의 파열 혹은 액포생성에 의해 달성되었음으로 사료된다. 홍조식물의 수정은 ROS (Reactive oxygen species) 유발 세포 과정을 연구하는 흥미로운 모델을 제공한다. B. moritziana에서 과산화수소 (H2O2) 신호가 배우자 결합, 정자 유사 분열 및 접합체의 발달을 포함한 수정의 중요한 단계에 관여한다는 것을 확인하였다. DAB 염색을 통해, 과산화수소의 축적이 정자의 표면에서 시작되어 정자와 수정모 사이의 수정관이 발달했을 때, 수정관에서 과산화수소의 축적이 관찰되었다. 이후 암배우체의 태원열까지 점차적으로 추적됨을 확인하였다. 과산화수소의 생성을 매개하는 NADPH-oxidase는 전사체 데이터베이스를 사용하여, 세개의 상동체 (Bmrboh1-3)를 확인하였다. qPCR를 통해, 배우체 결합 후 10-30 분 사이에 암배우체에서 , Bmrboh1-3유전자의 발현이 높게 발현됨을 확인하였다. NADPH-oxidase경로가 DPI에 의해 억제되었을 때, 수정의 진행이 중단되었다. 항산화제 또는 DPI처리 시 정자의 유사분열은 관찰되지 않았다. 이후 과산화수소의 외부 공급으로, DPI 전 처리된 정자에서 유사분열이 부분적으로 회복됨을 확인하였다. 위의 결과는 과산화수소가 수정 과정에 결정적인 영향을 미치는 신호 분자이며, 수정의 진행과 수정 후 발달에 필수적이라고 사료된다.
Diverse sex determination mechanisms have been reported in eukaryotes, but little is known about the genetic pathways leading to sex determination in red algae. Sex-specific genes that could be involved in sex determination and sexual differentiation were investigated in a red alga Bostrychia moritz...
Diverse sex determination mechanisms have been reported in eukaryotes, but little is known about the genetic pathways leading to sex determination in red algae. Sex-specific genes that could be involved in sex determination and sexual differentiation were investigated in a red alga Bostrychia moritziana by analyzing the transcriptomes of various phases including males, females and tetrasporophytes. Sex-dominantly-expressed genes which showed >10 fold difference between sexes were isolated using comparative RNA-seq analysis. We found 19 gene homologues, 10 from males and 9 from females, that were found only in one sex in genomic amplification using strains collected from five different localities. Most of the sex-specific genes are involved in important cellular processes including chromosome segregation, nucleo-cytoplasmic protein shuttling or tRNA modification. Quantitative PCR analysis showed that some sex-specific genes were differently regulated during critical events of sexual reproduction like fertilization and carposporophyte development. We could localize the expression of a male-specific gene in spermatia before and after gamete binding using RNA in situ hybridization. Amino acid sequence identity between male and female homologues of importin alpha gene and PreQ(0) reductase were highly divergent (75% and 74%, respectively), suggesting that these divergent homologues are on non-recombining UV-type chromosomes in their respective sexes. Another set of transcripts were found that were sex-dominantly-expressed, but not sex-speific. 19 out of 39 sex-dominantly-expressed transcripts were annotated to transposable elements. Red algal fertilization is unusual and offers a different model to the mechanism of intracellular transport of nuclei and polyspermy blocking. We tracked the movement of spermatial nuclei and cell organelles in the trichogyne after plasmogamy using time-lapse videography and fluorescent probes. The fertilization process of Bostrychia moritziana is composed of five distinctive stages: 1) gamete-gamete binding; 2) mitosis in the attached spermatia; 3) formation of a fertilization channel; 4) migration of spermatial nuclei into the trichogyne; and 5) karyogamy between gamete nuclei and cutting off of the trichogyne cytoplasm from the rest of the cell. this results showed that actin microfilaments were involved in the above steps of fertilization, with microtubules are involved only in spermatial mitosis. Time-lapse videography showed that the first (“primary”) nucleus which entered to trichogyne moved quickly to the base of carpogonium and fused with the female nucleus. The transport of the primary male nucleus to the egg nucleus was complete before its second nucleus migrated into the trichogyne. Male nuclei from other spermatia stopped directional movement soon after the first one entered the carpogonial base and oscillated near where they entered trichogyne. The cytoplasm of the trichogyne was cut off at a narrow neck connecting the trichogyne and carpogonial base after gamete nuclear fusion but gamete binding and plasmogamy continued on the trichogyne. Spermatial organelles, including mitochondria, entered the trichogyne together with the nuclei but did not show any directional movement and remained close to where they entered. These results suggest that polyspermy blocking in B. moritziana is achieved by the selective and rapid transport of the first nucleus entered trichogyne and the rupture of the trichogyne after gamete karyogamy. Red algal fertilization offers an interesting model to study ROS triggered cellular processes. This results showed that hydrogen peroxide (H2O2) signaling is involved in critical steps of fertilization including gamete binding, spermatial mitosis and the development of zygotes in a red alga Bostrychia moritziana. After gamete binding, H2O2 accumulated on the surface of sperm (spermatium) then transfer to trichogyne, a receptive area of the egg (carpogonium). A tight binding between the gametes was dependent on the accumulation of H2O2 at the contact area. When H2O2 was scavenged by an antioxidant, TEMPOL, the tight binding as well as the subsequent spermatial mitosis did not occurred. The fertilization did not progress when the cellular production of H2O2 was inhibited by the treatment of DPI, an inhibitor of NADPH-oxidase which mediates H2O2 production. When fertilization channel between spermatia and trichogyne developed H2O2 accumulation was observed in the membranous inclusions in trichogyne as well as connected carpogonial branch. Antioxidant or DPI treatment after the spermatial mitosis stopped formation of the fertilization channel. When the inhibitors were treated after putative karyogamy the post-fertilization development did not occur. The accumulation of H2O2 was observed in the apical cell of the indeterminate branch too. Intermittent treatment of weak concentration of TEMPOL to the female plants after fertilization inhibited the development of carposporophyte. Three homologues of NADPH-oxidase gene were identified. qPCR results showed that they were highly upregulated in female plants at 30 min after the gamete binding. When NADPH-oxidase pathway was inhibited by DPI the progress of fertilization stopped. This results suggest that the H2O2 signals involved in every step of the fertilization process and maintaining a basal level of H2O2 in gamete cells and zygotes is essential for the progress of fertilization as well as post-fertilization development.
Diverse sex determination mechanisms have been reported in eukaryotes, but little is known about the genetic pathways leading to sex determination in red algae. Sex-specific genes that could be involved in sex determination and sexual differentiation were investigated in a red alga Bostrychia moritziana by analyzing the transcriptomes of various phases including males, females and tetrasporophytes. Sex-dominantly-expressed genes which showed >10 fold difference between sexes were isolated using comparative RNA-seq analysis. We found 19 gene homologues, 10 from males and 9 from females, that were found only in one sex in genomic amplification using strains collected from five different localities. Most of the sex-specific genes are involved in important cellular processes including chromosome segregation, nucleo-cytoplasmic protein shuttling or tRNA modification. Quantitative PCR analysis showed that some sex-specific genes were differently regulated during critical events of sexual reproduction like fertilization and carposporophyte development. We could localize the expression of a male-specific gene in spermatia before and after gamete binding using RNA in situ hybridization. Amino acid sequence identity between male and female homologues of importin alpha gene and PreQ(0) reductase were highly divergent (75% and 74%, respectively), suggesting that these divergent homologues are on non-recombining UV-type chromosomes in their respective sexes. Another set of transcripts were found that were sex-dominantly-expressed, but not sex-speific. 19 out of 39 sex-dominantly-expressed transcripts were annotated to transposable elements. Red algal fertilization is unusual and offers a different model to the mechanism of intracellular transport of nuclei and polyspermy blocking. We tracked the movement of spermatial nuclei and cell organelles in the trichogyne after plasmogamy using time-lapse videography and fluorescent probes. The fertilization process of Bostrychia moritziana is composed of five distinctive stages: 1) gamete-gamete binding; 2) mitosis in the attached spermatia; 3) formation of a fertilization channel; 4) migration of spermatial nuclei into the trichogyne; and 5) karyogamy between gamete nuclei and cutting off of the trichogyne cytoplasm from the rest of the cell. this results showed that actin microfilaments were involved in the above steps of fertilization, with microtubules are involved only in spermatial mitosis. Time-lapse videography showed that the first (“primary”) nucleus which entered to trichogyne moved quickly to the base of carpogonium and fused with the female nucleus. The transport of the primary male nucleus to the egg nucleus was complete before its second nucleus migrated into the trichogyne. Male nuclei from other spermatia stopped directional movement soon after the first one entered the carpogonial base and oscillated near where they entered trichogyne. The cytoplasm of the trichogyne was cut off at a narrow neck connecting the trichogyne and carpogonial base after gamete nuclear fusion but gamete binding and plasmogamy continued on the trichogyne. Spermatial organelles, including mitochondria, entered the trichogyne together with the nuclei but did not show any directional movement and remained close to where they entered. These results suggest that polyspermy blocking in B. moritziana is achieved by the selective and rapid transport of the first nucleus entered trichogyne and the rupture of the trichogyne after gamete karyogamy. Red algal fertilization offers an interesting model to study ROS triggered cellular processes. This results showed that hydrogen peroxide (H2O2) signaling is involved in critical steps of fertilization including gamete binding, spermatial mitosis and the development of zygotes in a red alga Bostrychia moritziana. After gamete binding, H2O2 accumulated on the surface of sperm (spermatium) then transfer to trichogyne, a receptive area of the egg (carpogonium). A tight binding between the gametes was dependent on the accumulation of H2O2 at the contact area. When H2O2 was scavenged by an antioxidant, TEMPOL, the tight binding as well as the subsequent spermatial mitosis did not occurred. The fertilization did not progress when the cellular production of H2O2 was inhibited by the treatment of DPI, an inhibitor of NADPH-oxidase which mediates H2O2 production. When fertilization channel between spermatia and trichogyne developed H2O2 accumulation was observed in the membranous inclusions in trichogyne as well as connected carpogonial branch. Antioxidant or DPI treatment after the spermatial mitosis stopped formation of the fertilization channel. When the inhibitors were treated after putative karyogamy the post-fertilization development did not occur. The accumulation of H2O2 was observed in the apical cell of the indeterminate branch too. Intermittent treatment of weak concentration of TEMPOL to the female plants after fertilization inhibited the development of carposporophyte. Three homologues of NADPH-oxidase gene were identified. qPCR results showed that they were highly upregulated in female plants at 30 min after the gamete binding. When NADPH-oxidase pathway was inhibited by DPI the progress of fertilization stopped. This results suggest that the H2O2 signals involved in every step of the fertilization process and maintaining a basal level of H2O2 in gamete cells and zygotes is essential for the progress of fertilization as well as post-fertilization development.
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