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CRISPR/Cas 시스템에 기반 한 유전자 가위는 DNA 또는 RNA를 절단하는 이펙터 단백질(effector protein)과 특정 유전자 부위를 표적 하는 가이드 RNA(guide RNA)로 구성된다. 이러한 유전자 가위의 각 구성요소는 유전자 교정 효율 및 ...

CRISPR/Cas 시스템에 기반 한 유전자 가위는 DNA 또는 RNA를 절단하는 이펙터 단백질(effector protein)과 특정 유전자 부위를 표적 하는 가이드 RNA(guide RNA)로 구성된다. 이러한 유전자 가위의 각 구성요소는 유전자 교정 효율 및 특이성 등 다양한 측면에서 개선되었으며 최근에는 Cas 단백질과 특정 기능을 가진 단백질을 융합 하거나 crRNA를 개량하여 새로운 방식으로 유전자 교정을 유도하는 유전자 편집 기술들이 개발되었다. 본 연구에서는 crRNA 및 Cas 융합 단백질을 개량하여 CRISPR/Cas 기반의 유전자 편집 기술의 효율을 개선시키고 새로운 스크리닝 방법을 통해 특이성을 향상시키고자 하였다.
먼저, CRISPR/Cas12a의 guide RNA 개량하였다. Cas12a는 기존에 사용되던 Cas9과 비교하여 다양한 이점이 있음에도 불구하고 낮은 교정 효율로 인해 제한적으로 사용되었다. 따라서 Cas12a의 낮은 효율을 개선하기 위해 crRNA의 표적 유전자와 상보적인 20개의 염기서열 이후 3’말단에 다중의 유리디닐레이트(U8 또는 U4AU3)를 포함하도록 개량하였다. 그 결과, 개량된 형태의 U-rich crRNA는 기존의 Cas12a crRNA의 교정 효율과 비교하여 최대 13배 증가시켰으며 Cas9과 유사한 수준의 최적화된 편집 효율을 보였다. 역전사효소(Reverse transcripase)와 융합한 Cas9 nickase 및 프라임에디터 가이드 RNA(prime editor guide RNA, pegRNA)로 구성된 프라임에디터(Prime editor, PE)는 진핵 세포 내에서 손쉽고 획기적인 방법으로 유전자 교정이 가능하다고 평가되나 전체 유전체 수준에서의 비표적효과에 대해서는 연구된 바가 없었다. 따라서 프라임에디터의 특이성을 확인하기 위해 nickase-based Digenome-seq (nDigenome-seq)을 개발하였다. 개발된 in vitro nDigenome-seq 매우 낮은 수준의 비표적효과를 보이는 것을 확인하였다. 이를 토대로 세포 내 특정 비표적부위를 PCR하여 Deep-sequencing 한 결과, 0.1%에서 1.9%의 비표적효과를 보이는 5개의 비표적부위만 검출되었다. 또한 pegRNA의 PBS(primer binding site) 및 RT 영역(Reverse transcription region)에 길이 변화 및 표적 DNA 염기서열과의 불일치가 프라임에디터의 특이성에 영향을 주는 것으로 나타났다. 이후, 프라임에디터의 특이성 향상을 위해 Cas9 nickase를 개량된 다양한 종류의 Cas9 변이체로 치환한 결과, eSpCas9 및 Sniper Cas9이 기존 PE의 교정효율은 유지하며 특이성을 향상시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 PE의 각 구성요소가 모두 PE의 특이성에 영향을 미치는 요인이라는 것을 시사한다.
이렇게 발전된 CRISPR 기반의 유전자 편집 기술은 해당 기술의 기능 향상 및 CRISPR 기술의 적용 가능성을 확대시키며, 특히 난치성 유전 질환을 위한 유전자 치료제 개발 등에 기여할 것으로 기대된다.