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장내미생물은 소화기관에 살고 있는 미생물 (박테리아, 고세균, 바이러스, 곰팡이)의 집합체로 인간의 건강과 질병, 특히 장 질환에 관여된다. 장 질환 중에서도, 대장암과 C. difficile 감염증은 높은 치사율을 유발하는 생명에 위협적인 질병이며, 장내미생물과 가장 밀접하게 연관되어있다. 실제로, ...

장내미생물은 소화기관에 살고 있는 미생물 (박테리아, 고세균, 바이러스, 곰팡이)의 집합체로 인간의 건강과 질병, 특히 장 질환에 관여된다. 장 질환 중에서도, 대장암과 C. difficile 감염증은 높은 치사율을 유발하는 생명에 위협적인 질병이며, 장내미생물과 가장 밀접하게 연관되어있다. 실제로, 차세대 염기서열 분석 기술을 통해서, 건강한 사람과 장 질환 (대장암 또는 C. difficile 감염증)을 가진 환자 사이에 장내미생물 다양성과 풍부도에서 차이가 있다고 증명되어왔다. 많은 장내미생물들이 장 질환에 관련되어 있다는 군유전체학 (메타지노믹스)결과들이 있음에도 불구하고, 순수 배양된 장내미생물을 활용한 실험적인 증거는 유산균, Bacillus 종 그리고 Clostridium 종을 제외하면 꽤 제한되어있다. 그러한 이유로 우리는 대장암과 C. difficile 감염증을 억제하면서 건강인의 장에 존재하는 새로운 장내미생물을 밝히고자 하였다. 이러한 목표를 위해, 우리는 먼저 70명의 건강인의 분변으로부터 149종에 속하는 1,326개의 장내미생물 균주를 분리하였다. 장내미생물을 분리한 다음, 시험관내에서 항-대장암 활성과 항-Cd 활성을 대량의 장내미생물로 스크리닝하기 위해, 분리된 장내미생물로부터 배양상층액이 준비되었다.
항-대장암 연구에서는, 준비된 배양상층액이 대장암세포의 성장을 직접적으로 억제하는지 시험관내에서 평가되었고, 그 이후에 대장암세포에 대해 항-성장 활성을 나타내는 장내미생물들이 대장암 치료를 위한 후보군으로 선정되었다. 우리의 결과는 21개 장내미생물 균주의 배양상층액이 인간 유래 대장암세포인 HCT 116 세포에 대해 항-성장 활성을 나타냈다. 이러한 21개 균주 중에서, GM07 균주의 배양상층액이 마우스 유래 대장암세포인 CT 26 세포에 대한 가장 높은 항-성장 활성을 나타냈기 때문에, 추가 연구를 위해 선정되고, CT 26 동종이식 마우스 모델에서 더 평가되었다. 우선 계통 발생학적, 형태학적 분석에 근거한 다상적 증거에 기초하여, GM07 균주가 Odoribacter splanchnicus 로 확인되었다. O. splanchnicus 의 배양액 (OsCFS)의 항-성장 활성에 대해 조사한 결과, OsCFS 는 세포 주기를 멈추는 것이 아닌, 대장암세포의 세포자멸사를 유도함으로써 항-성장 활성을 나타낸다는 것이 증명되었다. OsCFS 의 항-성장 활성을 좀 더 입증하고자, 마우스 대장암세포의 이소이식에 의해 대장암 마우스 모델이 구축되었다. 마우스 모델에서, OsCFS 를 암 주변부에 주입하는 것이 대조군과 비교하여 대장암의 성장을 눈에 띄게 감소시켰다. 다음으로는, OsCFS 에 있는 항-대장암 물질의 특성 분석을 통해, 이 항-대장암 물질이 열 처리와 프로테이즈 처리에 안정적인 수용성 화합물임이 확인되었다. 게다가, 기체크로마토그래피 질량분석법과 고성능 액체 크로마토그래피를 통한 비교 분석에 근거하여, OsCFS 에 있는 항-대장암 추정물질이 말산으로 확인되었다. 추가적으로 말산은 OsCFS 와 유사한 정도로 대장암세포의 성장을 억제했다.
항-C. difficile 감염증 연구에서도, 먼저 100개의 배양상층액이 C. difficile 의 성장을 억제하는지 시험관내에서 평가되었다. 그 후에, C. difficile 에 대한 항균 활성 (항-Cd 활성)을 보이는 장내미생물이 C. difficile 감염증 치료를 위한 후보로 선정되었다. 100개의 배양상층액 중에서, 오직 GM68 균주의 배양상층액만이 항-Cd 활성을 나타냈고, C. difficile 감염증 치료를 위한 잠재적인 후보로 선정되었다. 우선 계통 발생학적, 형태학적 분석에 근거한 다상적 증거에 기초하여, GM68 균주가 Cutibacterium avidum 으로 확인되었다. 흥미롭게도, C. avidum 의 배양상층액 (CaCFS) 에 의한 항균 활성은 Lactobacills 종이나 Clostridium 종이 아닌 C. difficile 에 대한 특이적인 활성이라는 것을 보여주었다. 게다가, 항균 실험과 공생 배양실험의 결과를 토대로, C. avidum 에 의한 항-Cd 활성은 C. avidum 3개 균주 (GM68=KGMB02810, KGMB09337 그리고 KCTC 5339)중 KGMB02810 균주만 가지는 특별한 특성인 것으로 확인되었다. CaCFS 에 있는 항-Cd 물질에 대한 특성 분석을 통해, 26-30시간 동안 배양된 C.avidum 으로부터 준비 된 CaCFS 가 가장 높은 항-Cd 활성을 나타냈다. 이는 항-Cd 물질은 C. avidum 의 배양시간에 의존적이라는 것을 나타낸다. 추가적으로, 항-Cd 물질은 물리적 충격, 50도 이상의 열 그리고 프로테이즈에 민감하다는 것을 보여주었다. 이런 항-Cd 물질의 단백질성 특징에 기반하여, 우리는 항-Cd 활성이 과산화수소나 유기화합물이 아닌 단백질로부터 기원한 것을 확인했다. CaCFS 로부터 정제된 단백질체의 크기 분별법을 통해서 항-Cd 단백질의 추정 분자량이 30kDa 이하로 나타났다.
항-Cd 활성의 작용기전 연구에서, 주사전자현미경법, 투과전자현미경법과 면역형광법을 통해서 C. avidum 이 나타나는 항-Cd 활성은 C. difficile 의 세포벽을 파괴하여 나타나는 활성이라는 것이 증명되었다. C. avidum 의 항-Cd 활성을 더욱 입증하기위해, C. difficile 감염 마우스 모델이 장내미생물총 불균형의 유도 후 C. difficile 포자를 접종함으로써 구축되었다. C. difficile 감염 마우스 모델에서, C. avidum 의 경구투여는 C. difficile의 수를 감소시킴으로써 C. difficile 감염 증상을 완화시켰다. 게다가, 군유전체학 분석을 통해서, C. avidum 의 경구투여가 C. difficile 감염 마우스에 비교하여 장내미생물총의 풍부도나 다양성을 회복시켰다. 마지막으로, 항-Cd 단백질이 가지는 특징들인 분비 단백질, 세포벽 붕괴 활성 그리고 30kDa 이하의 분자량에 근거하여, 질량분석법을 통해 Ca1010이 항-Cd 단백질로 예측되었다.
종합해보자면, 이러한 발견들은 장내미생물-숙주 간의 상호관계에 대한 연구, 그리고 대장암과 C. difficile 감염증 예방 및 치료를 위해 적용될 수 있는 잠재적인 프로바이오틱스 후보군의 발견에 있어 가치 있는 정보를 제공할 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Gut microbiota (GM) which are microorganisms (bacteria, archaea, viruses and fungi) residing in the gastrointestinal tract are correlated with human health, especially with intestinal diseases. Among intestinal diseases, colorectal cancer (CRC) and Clostridioides difficile infection (CDI) are life-t...

Gut microbiota (GM) which are microorganisms (bacteria, archaea, viruses and fungi) residing in the gastrointestinal tract are correlated with human health, especially with intestinal diseases. Among intestinal diseases, colorectal cancer (CRC) and Clostridioides difficile infection (CDI) are life-threatening diseases leading to high morbi-mortality and are most closely related with GM. Indeed, it has been demonstrated by next-generation sequencing technique that there were differences in gut microbial diversity and abundance between healthy individuals and patients with the intestinal diseases. Despite the metagenomic results suggesting that many GM may be involved in the intestinal diseases, the experimental evidences using the isolated GM are quite limited, except for lactic acid bacteria (LAB), Bacillus spp. and Clostridium spp.. Hence, we have tried to identify novel GMs, inhabiting in the gut of healthy human and having potential ability to inhibit the development of intestinal diseases; focused on CRC and CDI. To achieve this goal, we isolated 1,326 bacterial strains which belong to 149 different species from the feces of 70 healthy individuals. After GM isolation, cell-free supernatants (CFSs) were prepared from the isolated gut microorganisms to efficiently screen a large amount of the GM for anti-CRC activity and anti-Cd activity in vitro.
In the anti-CRC study using 100 prepared CFSs, it was evaluated whether the CFSs directly inhibit the proliferation of CRC cells in vitro, then, GMs exhibiting anti-proliferative activity were selected as candidates for CRC treatment. Our results showed that the CFSs of 21 GM isolates exerted anti-proliferative activity against human colon cancer HCT 116 cells. Of these 21 GM isolates, GM07 was chosen for additional study because it had the highest anti-cancer activity against mouse colon cancer CT 26 cells in vitro and was further evaluated in a CT 26 allograft mouse model in vivo. On the basis of polyphasic evidence based on phylogenetic and morphologic analyses, GM07 isolate was identified as Odoribacter splanchnicus. Further investigation determined that the CFS of O. splanchnicus (OsCFS) induced anti-proliferative activity through apoptosis of CRC cells, but not cell-cycle arrest. To further verify the anti-CRC activity of OsCFS, the CRC mouse model was established by heterotopic implantation of mouse CRC cells. In CRC mouse model, peri-tumoral injection of OsCFS significantly reduced the development of CRC, compared to the control group. Through characterization of the anti-CRC agent in OsCFS, it was determined that the anti-CRC agent was aqueous compound, which was stable for heat- and protease-treatments. Moreover, based on the comparative analyses via GC/MS and HPLC, malic acid was identified as a putative anti-CRC agent in OsCFS. Additionally, malic acid inhibited the proliferation of CRC cell significantly, similar to OsCFS.
In the anti-CDI study, it was evaluated whether 100 CFSs inhibited the growth of C. difficile in vitro, then, GM exhibiting antibacterial activity against C. difficile, termed as anti-Cd activity, were selected as candidate for CDI treatment. Of 100 CFSs, only CFS of GM68 isolate showed anti-Cd activity in vitro, and was then selected as a potential candidate for CDI treatment. On the basis of polyphasic evidence based on phylogenetic and morphologic analyses, GM68 isolate was identified as Cutibacterium avidum. Interestingly, the range of antibacterial activity by CFS of C. avidum (CaCFS) showed a narrow spectrum with activity specific to C. difficile, not to Lactobacillus spp. and Clostridium spp.. In addition, based on the results of co-culture and antibacterial assay, the anti-Cd activity of C. avidum was the strain-specific property showing only C. avidum strain GM68 (=KGMB02810) had the anti-Cd activity among the three strains, KGMB02810, KGMB09337 and KCTC 5339. Through characterization of the anti-Cd agent in CaCFS, it was confirmed that the anti-Cd activity of CaCFS was highest when CaCFS was prepared from C. avidum cultured for 26-30 h, indicating that the production of anti-Cd agent was dependent on cultivation time of C. avidum. Additionally, the anti-Cd agent was sensitive to mechanical stress, heat and proteases, and was not H2O2 and organic compound. On the basis of the proteinaceous characteristics of the anti-Cd agent, we determined that the anti-Cd activity was originated from the protein. Through size-fractionation of protein crude purified from CaCFS (CaPPT), the tentative molecular weight of the anti-Cd protein was under 30 kDa.
In the mechanism study of the anti-Cd activity, it was demonstrated by microscopic analyses, including scanning electron microscopy, transmission electron microscopy and immunofluorescence staining, that the anti-Cd activity of C. avidum was caused by the disruption of the bacterial cell wall of C. difficile. To further verify the anti-Cd activity of C. avidum, the CDI mouse model was established by challenging C. difficile spores after induction of gut dysbiosis. In CDI mouse model, the oral administration of C. avidum attenuated the symptoms of CDI by reducing the number of C. difficile. Moreover, it was demonstrated through metagenomic analysis that the administration of C. avidum restored gut microbial richness and diversity, compared to the C. difficile-challenged mice. Finally, based on the characteristics of anti-Cd agent, including secretion protein, membrane disruptive activity and molecular mass of under 30 kDa, Ca1010 was predicted as the putative anti-Cd protein by FPLC, followed by mass spectrometric analysis.
Altogether, these findings will provide valuable information for the research of gut microbiota-host correlation and the discovery of potential probiotic candidates that can be applied for therapy and prevention of CRC and CDI.

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