유전자가위 기술은 동물의 형질 개량, 식물의 농작물 및 품종 개량뿐만 아니라 유전 질환 및 난치병 등 다양한 분야에 획기적인 기술로 급속도로 발전해 나가고 있다. 가장 널리 알려진 유전자가위 기술은 CRISPR-Cas9이다. 유전자가위는 표적 서열로 안내해주는 가이드 RNA와 표적 부위를 절단하는 Cas 단백질로 구성된다. 표적 서열을 절단하기 위해 Cas 단백질은 protospacer와 spacer의 ...
유전자가위 기술은 동물의 형질 개량, 식물의 농작물 및 품종 개량뿐만 아니라 유전 질환 및 난치병 등 다양한 분야에 획기적인 기술로 급속도로 발전해 나가고 있다. 가장 널리 알려진 유전자가위 기술은 CRISPR-Cas9이다. 유전자가위는 표적 서열로 안내해주는 가이드 RNA와 표적 부위를 절단하는 Cas 단백질로 구성된다. 표적 서열을 절단하기 위해 Cas 단백질은 protospacer와 spacer의 염기쌍이 형성되기 전에 protospacer adjacent modif (PAM) 서열을 식별해야 한다. 각 Cas 단백질은 PAM 서열에 대해 선호도를 가지고 있다. 예를 들어, Cas9 단백질은 5‘-NGG-3을 인식하고 Cas12a는 5’-TTTV-3’ (V=A/C/G)을 인식하며 Cas12f1은 5‘-TTTR-3’ (R=A/G)을 인식한다. CRISPR-Cas 시스템의 PAM 선호도를 고려할 때 특정 지역 내에서 표적 위치가 부족하거나 사용할 수 없다면 이러한 제한된 PAM 인식은 문제가 될 수 있다. 본 연구에서는 초소형 CRISPR 시스템을 이용하여 표적 부위를 확장할 수 있도록 하는 PAM 변이 CRISPR-Cas12f1 유전자가위 개발을 목표로 한다. 이를 위해 Cas12f1의 구조 분석을 통해 PAM 서열에 관여할 것으로 추정되는 여러 아미노산 서열로 다양한 후보물질을 선정하고 대장균에서 생산한 후 PAM 변이체의 절단 경향성을 시험하였다. 후보를 선정하는 동안 생체 내에서 TNTN PAM에 대해 절단 경향성을 보이는 모든 변이체를 스크리닝하였다. 그 후 HEK293T 세포에서 indel 형성 활성과 관련하여 후보 변이체를 조사하였다. 그 결과, 여러 Cas12f1 PAM 변이체를 개발할 수 있었으며 이는 초소형 유전자편집 플랫폼의 PAM 한계를 극복하여 다양한 유전자편집 치료제 개발의 기회를 확대하는데 기여할 것이다.
유전자가위 기술은 동물의 형질 개량, 식물의 농작물 및 품종 개량뿐만 아니라 유전 질환 및 난치병 등 다양한 분야에 획기적인 기술로 급속도로 발전해 나가고 있다. 가장 널리 알려진 유전자가위 기술은 CRISPR-Cas9이다. 유전자가위는 표적 서열로 안내해주는 가이드 RNA와 표적 부위를 절단하는 Cas 단백질로 구성된다. 표적 서열을 절단하기 위해 Cas 단백질은 protospacer와 spacer의 염기쌍이 형성되기 전에 protospacer adjacent modif (PAM) 서열을 식별해야 한다. 각 Cas 단백질은 PAM 서열에 대해 선호도를 가지고 있다. 예를 들어, Cas9 단백질은 5‘-NGG-3을 인식하고 Cas12a는 5’-TTTV-3’ (V=A/C/G)을 인식하며 Cas12f1은 5‘-TTTR-3’ (R=A/G)을 인식한다. CRISPR-Cas 시스템의 PAM 선호도를 고려할 때 특정 지역 내에서 표적 위치가 부족하거나 사용할 수 없다면 이러한 제한된 PAM 인식은 문제가 될 수 있다. 본 연구에서는 초소형 CRISPR 시스템을 이용하여 표적 부위를 확장할 수 있도록 하는 PAM 변이 CRISPR-Cas12f1 유전자가위 개발을 목표로 한다. 이를 위해 Cas12f1의 구조 분석을 통해 PAM 서열에 관여할 것으로 추정되는 여러 아미노산 서열로 다양한 후보물질을 선정하고 대장균에서 생산한 후 PAM 변이체의 절단 경향성을 시험하였다. 후보를 선정하는 동안 생체 내에서 TNTN PAM에 대해 절단 경향성을 보이는 모든 변이체를 스크리닝하였다. 그 후 HEK293T 세포에서 indel 형성 활성과 관련하여 후보 변이체를 조사하였다. 그 결과, 여러 Cas12f1 PAM 변이체를 개발할 수 있었으며 이는 초소형 유전자편집 플랫폼의 PAM 한계를 극복하여 다양한 유전자편집 치료제 개발의 기회를 확대하는데 기여할 것이다.
Genome editing technology has been rapidly developed as a breakthrough technology in various fields such as genetic and incurable diseases, as well as development of new plant and animal varieties. The most widely known technology is the CRISPR-Cas system, which is represented by CRISPR-Cas9. The ge...
Genome editing technology has been rapidly developed as a breakthrough technology in various fields such as genetic and incurable diseases, as well as development of new plant and animal varieties. The most widely known technology is the CRISPR-Cas system, which is represented by CRISPR-Cas9. The genome editing tool consists of a guide RNA that guides to a target sequence and a Cas protein that cleavages the targeted region. To achieve sequence-specific cleavage, the Cas protein must identify a protospacer adjacent modif (PAM) sequence prior to protospacer-spacer base pairing. Each Cas protein has a distinct preference for PAM sequence. For instance, Cas9 protein recognizes 5'-NGG-3', Cas12a recognizes 5'-TTTV-3' (V=A/C/G), and Cas12f1 recognizes 5'-TTTR-3' (R=A/G). Given the PAM preference of each CRISPR-Cas system, the limited recognition could be problematic due to the lack or unavailability of targetable sites within a certain region. In this study, we aim to develop PAM variants of Cas12f1 so that they can expand the targetable sites using the hypercompact CRISPR system. For this aim, various candidates were selected by several amino acid sequences the are assumed to be involved in the recognition of the PAM sequence through the structural analysis of Cas12f1, and the cleavage pattern of the PAM variants were tested following the production in E. coli cells. During the selection of candidates, any variants with the cleavage for TNTN PAM were screened in in vitro system. Thereafter, the candidate variants were investigated in HEK293T cells with repect to the indel formation activity. As a results, we could develop several Cas12f1 PAM variants will contribute to expanding the opportunites for the development of various gene-editing therapeutics by overcoming the PAM limitation of our hypercompact genome-editing platform.
Genome editing technology has been rapidly developed as a breakthrough technology in various fields such as genetic and incurable diseases, as well as development of new plant and animal varieties. The most widely known technology is the CRISPR-Cas system, which is represented by CRISPR-Cas9. The genome editing tool consists of a guide RNA that guides to a target sequence and a Cas protein that cleavages the targeted region. To achieve sequence-specific cleavage, the Cas protein must identify a protospacer adjacent modif (PAM) sequence prior to protospacer-spacer base pairing. Each Cas protein has a distinct preference for PAM sequence. For instance, Cas9 protein recognizes 5'-NGG-3', Cas12a recognizes 5'-TTTV-3' (V=A/C/G), and Cas12f1 recognizes 5'-TTTR-3' (R=A/G). Given the PAM preference of each CRISPR-Cas system, the limited recognition could be problematic due to the lack or unavailability of targetable sites within a certain region. In this study, we aim to develop PAM variants of Cas12f1 so that they can expand the targetable sites using the hypercompact CRISPR system. For this aim, various candidates were selected by several amino acid sequences the are assumed to be involved in the recognition of the PAM sequence through the structural analysis of Cas12f1, and the cleavage pattern of the PAM variants were tested following the production in E. coli cells. During the selection of candidates, any variants with the cleavage for TNTN PAM were screened in in vitro system. Thereafter, the candidate variants were investigated in HEK293T cells with repect to the indel formation activity. As a results, we could develop several Cas12f1 PAM variants will contribute to expanding the opportunites for the development of various gene-editing therapeutics by overcoming the PAM limitation of our hypercompact genome-editing platform.
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