중국 햄스터 난소(Chinses hamster ovary; CHO) 세포는 단일클론 항체(mAb)를 포함한 치료용 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 산업용 세포주이다. 글루타민합성 효소(Glutamine synthetase; ...
중국 햄스터 난소(Chinses hamster ovary; CHO) 세포는 단일클론 항체(mAb)를 포함한 치료용 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 산업용 세포주이다. 글루타민합성 효소(Glutamine synthetase; GS) 와 다이하이드로폴레이트 환원 효소(Dihydrofolate reductase; DHFR)의 녹아웃을 이용한 세포주 개발 및 유전자 증폭 기술은 치료용 단백질 생산의 안정성, 생산성 및 시간 절약에 많은 기여를 하였다. 하지만, 수 많은 단일클론 중에서 고생산성 세포주를 선별하는 것은 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라, 매우 어려운 일이다. 현재 보편적으로 사용되는 GS 녹아웃, DHFR 녹아웃 CHO-K1 세포주를 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9(CRISPR/Cas9) 유전자 편집기술을 이용하여 자체 개발하였으며, 나아가 CRISPR/Cas9 유전자 편집기술을 이용하여 GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주를 최초로 확립하였다. 본 연구에서는 각각의 세포주 특징을 분석하고, 치료용 항체 발현 벡터를 도입하여 세포주 간에 항체 발현율을 비교 분석하였다. 결과적으로 GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주는 치료용 항체 발현을 위한 벡터 2종을 동시에 도입할 수 있었으며, 글루타민(Gln) 과 히포크산틴, 티민(HT)를 이용한 이중 선별과정을 통해 각각의 벡터가 안정적으로 삽입된 생산 세포주 후보군을 빠르게 구축할 수 있었다. 항체 발현 역가(力價)를 분석한 결과, GS/DHFR 이중 녹아웃 세포주가 CHO-K1 일반형, GS 녹아웃, DHFR 녹아웃 CHO-K1 세포주 보다 뚜렷하게 높은 항체 생산성을 가지는 것을 확인하였다. GS 녹아웃 및 DHFR 녹아웃 CHO-K1 세포주는 GS 코딩영역(엑손 4)와 DHFR 코딩 영역(엑손1)을 각각 표적하는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용하였고, 다종(6종)의 후보군의 형태학적 특징 및 성장률을 분석하여, CHO-K1 일반형과 유사한 단일클론 녹아웃 세포주를 확립하였다. GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주는 기확립된 DHFR 녹아웃 CHO-K1 세포주에 GS 코딩영역(엑손4)를 표적하는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 추가로 사용하여 확립하였다. 이를 통해, GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 단일클론 후보군(6종)를 선별하였으며, 형태학적 특징 및 성장률이 CHO-K1 일반형과 유사한 단일클론 녹아웃 세포주를 확립하였다. 치료 단백질의 대량 생산을 위해선 부착 세포를 무혈청 배지에서 부유 세포로 적응시키는 것이 필수 불가결하다. 따라서, GS 녹아웃, DHFR 녹아웃, GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 부착 세포를 무혈청배지에서 부유 배양 적응을 통해 부유 세포로 적응 시켰다. GS 녹아웃, DHFR 녹아웃, GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주는 형태학적 차이 없이 CHO-K1 일반형과 유사한 성장률을 가진 것을 확인하였다. 또한, 글루타민(Gln) 및/또는 히포크산틴 과 티민(HT)의 유무에 따른 세포주의 성장이 명확하게 다른 것을 정치 배양 및 부유 배양에서 확인하였다. 해당 연구를 통해, 세포주의 염색체 내부에 안정적으로 삽입된 치료용 항체 발현 벡터의 카피 수가 항체 생산성과 상관관계가 있음을 확인하였다. GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주는 GS 녹아웃 세포주가 사용하는 유전자 증폭시스템인 메티오닌 설폭시민(MSX)과 DHFR 녹아웃 세포주가 사용하는 유전자 증폭시스템인 메토트렉세이트 (MTX)를 모두 사용할 수 있기 때문에 치료 단백질의 생산량 차이가 단일 녹아웃 CHO-K1 세포주와 더 커질 것으로 보인다. 이를 통해, GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주가 기존에 상용화된 단일 녹아웃 CHO-K1 세포주를 대체할 새로운 고생산성 세포주가 될 것으로 기대한다
중국 햄스터 난소(Chinses hamster ovary; CHO) 세포는 단일클론 항체(mAb)를 포함한 치료용 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 산업용 세포주이다. 글루타민 합성 효소(Glutamine synthetase; GS) 와 다이하이드로폴레이트 환원 효소(Dihydrofolate reductase; DHFR)의 녹아웃을 이용한 세포주 개발 및 유전자 증폭 기술은 치료용 단백질 생산의 안정성, 생산성 및 시간 절약에 많은 기여를 하였다. 하지만, 수 많은 단일클론 중에서 고생산성 세포주를 선별하는 것은 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라, 매우 어려운 일이다. 현재 보편적으로 사용되는 GS 녹아웃, DHFR 녹아웃 CHO-K1 세포주를 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9(CRISPR/Cas9) 유전자 편집기술을 이용하여 자체 개발하였으며, 나아가 CRISPR/Cas9 유전자 편집기술을 이용하여 GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주를 최초로 확립하였다. 본 연구에서는 각각의 세포주 특징을 분석하고, 치료용 항체 발현 벡터를 도입하여 세포주 간에 항체 발현율을 비교 분석하였다. 결과적으로 GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주는 치료용 항체 발현을 위한 벡터 2종을 동시에 도입할 수 있었으며, 글루타민(Gln) 과 히포크산틴, 티민(HT)를 이용한 이중 선별과정을 통해 각각의 벡터가 안정적으로 삽입된 생산 세포주 후보군을 빠르게 구축할 수 있었다. 항체 발현 역가(力價)를 분석한 결과, GS/DHFR 이중 녹아웃 세포주가 CHO-K1 일반형, GS 녹아웃, DHFR 녹아웃 CHO-K1 세포주 보다 뚜렷하게 높은 항체 생산성을 가지는 것을 확인하였다. GS 녹아웃 및 DHFR 녹아웃 CHO-K1 세포주는 GS 코딩영역(엑손 4)와 DHFR 코딩 영역(엑손1)을 각각 표적하는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용하였고, 다종(6종)의 후보군의 형태학적 특징 및 성장률을 분석하여, CHO-K1 일반형과 유사한 단일클론 녹아웃 세포주를 확립하였다. GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주는 기확립된 DHFR 녹아웃 CHO-K1 세포주에 GS 코딩영역(엑손4)를 표적하는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 추가로 사용하여 확립하였다. 이를 통해, GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 단일클론 후보군(6종)를 선별하였으며, 형태학적 특징 및 성장률이 CHO-K1 일반형과 유사한 단일클론 녹아웃 세포주를 확립하였다. 치료 단백질의 대량 생산을 위해선 부착 세포를 무혈청 배지에서 부유 세포로 적응시키는 것이 필수 불가결하다. 따라서, GS 녹아웃, DHFR 녹아웃, GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 부착 세포를 무혈청배지에서 부유 배양 적응을 통해 부유 세포로 적응 시켰다. GS 녹아웃, DHFR 녹아웃, GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주는 형태학적 차이 없이 CHO-K1 일반형과 유사한 성장률을 가진 것을 확인하였다. 또한, 글루타민(Gln) 및/또는 히포크산틴 과 티민(HT)의 유무에 따른 세포주의 성장이 명확하게 다른 것을 정치 배양 및 부유 배양에서 확인하였다. 해당 연구를 통해, 세포주의 염색체 내부에 안정적으로 삽입된 치료용 항체 발현 벡터의 카피 수가 항체 생산성과 상관관계가 있음을 확인하였다. GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주는 GS 녹아웃 세포주가 사용하는 유전자 증폭시스템인 메티오닌 설폭시민(MSX)과 DHFR 녹아웃 세포주가 사용하는 유전자 증폭시스템인 메토트렉세이트 (MTX)를 모두 사용할 수 있기 때문에 치료 단백질의 생산량 차이가 단일 녹아웃 CHO-K1 세포주와 더 커질 것으로 보인다. 이를 통해, GS/DHFR 이중 녹아웃 CHO-K1 세포주가 기존에 상용화된 단일 녹아웃 CHO-K1 세포주를 대체할 새로운 고생산성 세포주가 될 것으로 기대한다
Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most widely used industrial host for the manufacture of therapeutic proteins, including monoclonal antibodies (mAb). The development of CHO-K1 knockout (KO) cell lines for glutamine synthetase (GS) and dihydrofolate reductase (DHFR) and gene amplification te...
Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most widely used industrial host for the manufacture of therapeutic proteins, including monoclonal antibodies (mAb). The development of CHO-K1 knockout (KO) cell lines for glutamine synthetase (GS) and dihydrofolate reductase (DHFR) and gene amplification technology improved the stability, productivity, and time-saving of the production of therapeutic proteins. However, it is a great challenge to select only the high-producing clones among numerous clones. We developed CHO-K1-based GS KO, and DHFR KO cell lines using Clustered Regularly interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 gene-editing system, and furthermore, we first developed the GS/DHFR double knockout (dKO) cell line with CHO-K1 using CRISPR/Cas9 gene editing system. The auxotroph characteristics of each cell line were analyzed, and a comparison of antibody titer with each cell line was conducted after the transfection of the therapeutic protein expression vector. As a result, we were able to construct a stable GS/DHFR dKO transfected pool by simultaneous transfection with two vectors (GS and DHFR co-expressing therapeutic protein expression vector) with a double selection process using glutamine (Gln), and hypoxanthine and thymine (HT). Through these experiments, we confirmed that the GS/DHFR dKO transfected stable pool had significantly higher antibody productivity than CHO-K1 WT, GS KO, and DHFR KO transfected stable pool. GS KO and DHFR KO cell lines were developed using the CRISPR/Cas9 system targeting the DHFR coding region (exon 1), and GS coding region (exon 4). GS KO and DHFR KO top clones were selected by analyzing morphological differences and the growth rate of 6 different single clones. GS/DHFR dKO cell line was developed using CRISPR/Cas9 gene-editing techniques targeting GS coding region (exon 4) in a pre-established DHFR KO cell line. GS/DHFR dKO top clone was selected by analyzing morphological differences and growth rate of 6 different single clones. In order to mass-produce therapeutic proteins, it is essential to adapt attached cells to suspension cells with serum-free media. Therefore, adherent GS KO, DHFR KO, and GS/DHFR dKO cells were adapted to suspension cells through serum-free media suspension adaptation. All suspension-adapted cell lines were showing similar growth rates compared to CHO-K1 WT with no morphological differences. And, most importantly, glutamine (Gln) and/or hypoxanthine and thymidine (HT) auxotroph phenotype in GS/DHFR dKO cell line was clearly identified in static and suspension cultures compared to CHO-K1 WT. In this study, we found that copy number of therapeutic protein genes correlates with therapeutic protein production. GS/DHFR dKO cell line is able to use both Methionine sulfoximine (MSX) and Methotrexate (MTX) gene amplification system; GS/MSX-mediated gene amplification system, and DHFR/MTX-mediated gene amplification system. By using the GS/DHFR dKO cell line, it is expected that the difference in the productivity of therapeutic proteins will be greater than that of GS KO, and DHFR KO cell lines when using a gene amplification system. Through this, we anticipate our GS/DHFR dKO cell line will be a new high-productivity cell line to replace the previously commercialized therapeutic protein production cell lines.
Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most widely used industrial host for the manufacture of therapeutic proteins, including monoclonal antibodies (mAb). The development of CHO-K1 knockout (KO) cell lines for glutamine synthetase (GS) and dihydrofolate reductase (DHFR) and gene amplification technology improved the stability, productivity, and time-saving of the production of therapeutic proteins. However, it is a great challenge to select only the high-producing clones among numerous clones. We developed CHO-K1-based GS KO, and DHFR KO cell lines using Clustered Regularly interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 gene-editing system, and furthermore, we first developed the GS/DHFR double knockout (dKO) cell line with CHO-K1 using CRISPR/Cas9 gene editing system. The auxotroph characteristics of each cell line were analyzed, and a comparison of antibody titer with each cell line was conducted after the transfection of the therapeutic protein expression vector. As a result, we were able to construct a stable GS/DHFR dKO transfected pool by simultaneous transfection with two vectors (GS and DHFR co-expressing therapeutic protein expression vector) with a double selection process using glutamine (Gln), and hypoxanthine and thymine (HT). Through these experiments, we confirmed that the GS/DHFR dKO transfected stable pool had significantly higher antibody productivity than CHO-K1 WT, GS KO, and DHFR KO transfected stable pool. GS KO and DHFR KO cell lines were developed using the CRISPR/Cas9 system targeting the DHFR coding region (exon 1), and GS coding region (exon 4). GS KO and DHFR KO top clones were selected by analyzing morphological differences and the growth rate of 6 different single clones. GS/DHFR dKO cell line was developed using CRISPR/Cas9 gene-editing techniques targeting GS coding region (exon 4) in a pre-established DHFR KO cell line. GS/DHFR dKO top clone was selected by analyzing morphological differences and growth rate of 6 different single clones. In order to mass-produce therapeutic proteins, it is essential to adapt attached cells to suspension cells with serum-free media. Therefore, adherent GS KO, DHFR KO, and GS/DHFR dKO cells were adapted to suspension cells through serum-free media suspension adaptation. All suspension-adapted cell lines were showing similar growth rates compared to CHO-K1 WT with no morphological differences. And, most importantly, glutamine (Gln) and/or hypoxanthine and thymidine (HT) auxotroph phenotype in GS/DHFR dKO cell line was clearly identified in static and suspension cultures compared to CHO-K1 WT. In this study, we found that copy number of therapeutic protein genes correlates with therapeutic protein production. GS/DHFR dKO cell line is able to use both Methionine sulfoximine (MSX) and Methotrexate (MTX) gene amplification system; GS/MSX-mediated gene amplification system, and DHFR/MTX-mediated gene amplification system. By using the GS/DHFR dKO cell line, it is expected that the difference in the productivity of therapeutic proteins will be greater than that of GS KO, and DHFR KO cell lines when using a gene amplification system. Through this, we anticipate our GS/DHFR dKO cell line will be a new high-productivity cell line to replace the previously commercialized therapeutic protein production cell lines.
주제어
#Chinese hamster ovary (CHO) cells Glutamine synthetase (GS) dihydrofolate reductase (DHFR) Cell line development monoclonal antibody (mAb) production
학위논문 정보
저자
김재휘
학위수여기관
과학기술연합대학원대학교
학위구분
국내석사
학과
생물공정공학(BioprocessEngineering)
지도교수
이홍원
발행연도
2023
키워드
Chinese hamster ovary (CHO) cells Glutamine synthetase (GS) dihydrofolate reductase (DHFR) Cell line development monoclonal antibody (mAb) production
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