시토크롬P450 모노옥시게나제(CYP 또는 P450)는 대부분의 생물에서 흔하게 발견할 수 있는 heme-thiolate 단백질로, 입체 선택적 수산화, 에폭시화, N-산화, 탈메틸화, N-, O- 및 S-탈알킬화 등 다양한 반응을 촉매 합니다. 그리고 그것들을 합성 및 응용을 위한 잠재적인 생체 촉매로 만듭니다. 박테리아 P450 효소는 일반적으로 세포질, 수용성이며 높은 수준의 안정성을 나타내므로 다양한 ...
시토크롬P450 모노옥시게나제(CYP 또는 P450)는 대부분의 생물에서 흔하게 발견할 수 있는 heme-thiolate 단백질로, 입체 선택적 수산화, 에폭시화, N-산화, 탈메틸화, N-, O- 및 S-탈알킬화 등 다양한 반응을 촉매 합니다. 그리고 그것들을 합성 및 응용을 위한 잠재적인 생체 촉매로 만듭니다. 박테리아 P450 효소는 일반적으로 세포질, 수용성이며 높은 수준의 안정성을 나타내므로 다양한 생명 공학 응용 분야에 적합합니다. 본 연구는 시토크롬 P450의 촉매 잠재력 조사, 기능 및 구조적 연구 그리고 응용에 초점을 두고 있습니다.
스테로이드는 광범위한 치료 효과가 있는 편재된 생체 활성 화합물입니다. 각각 Streptomyces sp. W2061과 Streptomyces sp. KCCM40643에서 유래된 CYP154C3-1 및 CYP154C3‐2는 이종 산화 환원 파트너로 putidaredoxin과 putidaredoxin reductase를 사용했을 때 가장 높은 활성과 선택성을 가졌으며, 다양한 스테로이드에 수산화 반응을 촉매 할 수 있습니다. 두 효소는 30~37°C의 온도 범위 그리고 7.0~7.8의 pH 범위에서 우수한 활성을 나타냈습니다. 주요 생성물은 C16-수산화 생성물이었고, 생성된 수산화 생성물의 동역학 프로파일 및 패턴은 두 효소 간에 상이하였다. 산화제(diacetoxyiodo), 벤젠(PIDA)(3mM) 그리고 과산화수소(H2O2)(65mM)도 산화 환원 파트너로서 사용되었습니다. 산화제는 P450의 촉매 반응 유형과 선택에 영향을 주어 다양한 생성물의 생산을 가능하게 하였습니다. 또한 CYP154C3s는 스테로이드의 C-C 결합 절단을 촉매 하기도 했습니다. 따라서 CYP154C3는 다양한 생물학적 용도로 변형된 스테로이드를 생산할 수 있는 좋은 후보가 될 수 있습니다.
Streptomyces sp.의 CYP105A5에 대한 연구는 Biochanin A의 O-탈메틸화와 daidzein, genistein 및 naringenin의 위치 선택적 C3'-수산화, 그리고 이종 산화 환원 파트너인 putidaredoxin 및 putidaredoxin reductase를 사용하여 daidzein에 대한 추가적인 C8-수산화를 촉매 하는 다양한 플라보노이드로 기질 유연성을 보여주었습니다. 실험 데이터, 상동성모델링 및 분자 도킹 분석을 기반으로 한 분석을 통해서 플라보노이드 생성물 형성률을 향상시켰습니다. 이중 돌연변이 L100A/I302A 와 L100A/I408N은 플라보노이드 수산화에 대한 생체 내 전환율이 크게 향상되었습니다. 특히 변이체의 kcat/Km 값은 naringenin에 대해 1.68배, 생체 내 전환율이 2.57배 증가했습니다. 전반적으로, 우리의 결과는 가치 있는 폴리페놀을 생산하기 위해 전체 세포 생체 촉매에 향후 수정 및 적용을 위해서 잠재력이 있는 후보로서 CYP105A5의 사용을 가능하게 합니다.
CYP101D는 naringenin과 apigenin을 포함한 flavonoids와 β-ionone의 수산화 반응을 매개하였으며, 또한 α-ionone의 탈수소화 반응도 확인할 수 있었다. 지금까지 CYP101 계열 단백질은 camphor 및 ionone과 같은 작은 분자의 수산화로 유명했습니다. 그러나 CYP101D5는 촉매와 기질 모두에서 특이한 특징을 보였습니다. 게다가, Ionone의 탈수소화 반응은 CYP101D 서브 패밀리에서 완전히 새로운 반응입니다. 또한, CYP101D5는 플라보노이드와 같은 더 큰 기질의 수산화 반응을 입증했는데, 이는 그동안 CYP101D 계열에서 관찰되지 않았을 뿐만 아니라 박테리아 CYP의 촉매에 의해 드물게 발생하는 생체 변형입니다. CYP101D5와 다른 CYP101 계열 사이의 구조적 비교는 B/C 루프 방향의 교대가 CYP101D5의 기질 선호도를 변경하는 더 큰 활성 사이트를 생성했음을 나타냅니다. 이전 연구에서 B/C 루프가 작은 기질 인식의 원인일 수 있음을 보여주었지만, CYP101 제품군의 구조에서는 큰 기질에 대한 B/C 루프의 다른 방향이 표시되지 않았습니다.
CYP154C4는 스테로이드를 수산화시키는 것으로 잘 알려져 있으며, 이 외에도 약물로 사용되는 papaverine의 N-수산화반응을 촉매할 수 있었습니다. CYP154C4의 천연 산화환원 파트너는 알려지지 않았기 때문에 시험관 내 활동은 값비싼 다른 산화환원 파트너에 의존해 왔습니다. 여기에서 우리는 촉매 효율을 보여주는 산화환원 파트너에 융합된 단일 구성 요소 박테리아 생합성 CYP154C4의 생체 외 반응의 특성을 설명합니다. CYP154C4의 산화 환원 파트너는 구조 시뮬레이션, 분자 도킹 및 분자 역학 시뮬레이션 분석을 기반으로 선택되었습니다. 산화환원 파트너와 CYP 간의 분자 인식 및 상호작용에 관한 정보를 활용하여 Rhodococcus의 RhFRED를 선택하여 융합 시스템에 대한 대체 전자 전달 경로를 조사했습니다. CYP154C4는 기존의 16개 아미노산 링커 서열을 포함하여 RhFRED 유전자와 연결되었습니다. 융합 단백질에 의한 N-산화물의 생산은 CYP154C4-RhFRED가 자급자족 P450 효소임을 명백히 확인시켜 줍니다. 산소 결합 영역 T242E에서의 돌연변이는 효소의 퍼옥시게나제 활성을 증가시켰다. 반면 T242A는 papaverine의 N-산화 반응에서 중요하지만 알려지지 않은 메커니즘을 설명하는 퍼옥시게나제 활성에 영향을 미치지 않았습니다.
우리는 또한 여러 효소를 사용하여 화합물의 생체 변환을 수행했습니다. 우리는 스테로이드의 수산화 및 후속 당화를 위한 one-pot 시스템을 설계했습니다. 산화환원 파트너 Pdx/PdR 및 당전이효소 UGT-1과 함께 글루코스 공여체와 함께 스테로이드 수산화효소 CYP154C3를 사용하였다. C16 위치에서 수산화된 progesterone은 이어서 당화되었다. 기존의 progesterone에 비해서 수용성이 각각 2.74배, 51.36배 증가된 고용해성 수산화 progesterone과 progesterone 배당체를 얻었다. 우리는 또한 생체 내 수산화 반응과 naringenin의 후속 메틸화를 수행했습니다. 이를 위해, 산화환원 파트너 Pdx/PdR 및 O-메틸전이효소와 함께 CYP105A5를 갖는 대장균 컨소시엄을 사용하였다. 컨소시엄에서 두 모듈의 발현양이 높을수록 메틸전이효소 반응력이 높았고, homoeriodictyol과 hesperetin의 생산이 증가함을 알 수 있었다. 생체 변환 12시간 후, 기질의 70%가 메틸화된 생성물로 전환되었다.
최종적으로, 이 연구 작업은 P450 효소의 기질 유연성과 촉매 다양성을 설명합니다. 우리의 연구는 P450이 단백질 공학의 미래 적용에 의해 그들의 활동을 변경 및/또는 개선할 수 있는 좋은 후보가 될 수 있음을 보여주었습니다. 또한 단순 발효를 사용하여 one-pot 효소 반응 시스템과 전체 세포 생체 촉매에서 이러한 단백질을 적용하여 다른 접근 방식에 비해 더 저렴하고 확장하기 쉬운 가치 있는 파생물을 생산하는 방법을 조사했습니다.
시토크롬 P450 모노옥시게나제(CYP 또는 P450)는 대부분의 생물에서 흔하게 발견할 수 있는 heme-thiolate 단백질로, 입체 선택적 수산화, 에폭시화, N-산화, 탈메틸화, N-, O- 및 S-탈알킬화 등 다양한 반응을 촉매 합니다. 그리고 그것들을 합성 및 응용을 위한 잠재적인 생체 촉매로 만듭니다. 박테리아 P450 효소는 일반적으로 세포질, 수용성이며 높은 수준의 안정성을 나타내므로 다양한 생명 공학 응용 분야에 적합합니다. 본 연구는 시토크롬 P450의 촉매 잠재력 조사, 기능 및 구조적 연구 그리고 응용에 초점을 두고 있습니다.
스테로이드는 광범위한 치료 효과가 있는 편재된 생체 활성 화합물입니다. 각각 Streptomyces sp. W2061과 Streptomyces sp. KCCM40643에서 유래된 CYP154C3-1 및 CYP154C3‐2는 이종 산화 환원 파트너로 putidaredoxin과 putidaredoxin reductase를 사용했을 때 가장 높은 활성과 선택성을 가졌으며, 다양한 스테로이드에 수산화 반응을 촉매 할 수 있습니다. 두 효소는 30~37°C의 온도 범위 그리고 7.0~7.8의 pH 범위에서 우수한 활성을 나타냈습니다. 주요 생성물은 C16-수산화 생성물이었고, 생성된 수산화 생성물의 동역학 프로파일 및 패턴은 두 효소 간에 상이하였다. 산화제(diacetoxyiodo), 벤젠(PIDA)(3mM) 그리고 과산화수소(H2O2)(65mM)도 산화 환원 파트너로서 사용되었습니다. 산화제는 P450의 촉매 반응 유형과 선택에 영향을 주어 다양한 생성물의 생산을 가능하게 하였습니다. 또한 CYP154C3s는 스테로이드의 C-C 결합 절단을 촉매 하기도 했습니다. 따라서 CYP154C3는 다양한 생물학적 용도로 변형된 스테로이드를 생산할 수 있는 좋은 후보가 될 수 있습니다.
Streptomyces sp.의 CYP105A5에 대한 연구는 Biochanin A의 O-탈메틸화와 daidzein, genistein 및 naringenin의 위치 선택적 C3'-수산화, 그리고 이종 산화 환원 파트너인 putidaredoxin 및 putidaredoxin reductase를 사용하여 daidzein에 대한 추가적인 C8-수산화를 촉매 하는 다양한 플라보노이드로 기질 유연성을 보여주었습니다. 실험 데이터, 상동성 모델링 및 분자 도킹 분석을 기반으로 한 분석을 통해서 플라보노이드 생성물 형성률을 향상시켰습니다. 이중 돌연변이 L100A/I302A 와 L100A/I408N은 플라보노이드 수산화에 대한 생체 내 전환율이 크게 향상되었습니다. 특히 변이체의 kcat/Km 값은 naringenin에 대해 1.68배, 생체 내 전환율이 2.57배 증가했습니다. 전반적으로, 우리의 결과는 가치 있는 폴리페놀을 생산하기 위해 전체 세포 생체 촉매에 향후 수정 및 적용을 위해서 잠재력이 있는 후보로서 CYP105A5의 사용을 가능하게 합니다.
CYP101D는 naringenin과 apigenin을 포함한 flavonoids와 β-ionone의 수산화 반응을 매개하였으며, 또한 α-ionone의 탈수소화 반응도 확인할 수 있었다. 지금까지 CYP101 계열 단백질은 camphor 및 ionone과 같은 작은 분자의 수산화로 유명했습니다. 그러나 CYP101D5는 촉매와 기질 모두에서 특이한 특징을 보였습니다. 게다가, Ionone의 탈수소화 반응은 CYP101D 서브 패밀리에서 완전히 새로운 반응입니다. 또한, CYP101D5는 플라보노이드와 같은 더 큰 기질의 수산화 반응을 입증했는데, 이는 그동안 CYP101D 계열에서 관찰되지 않았을 뿐만 아니라 박테리아 CYP의 촉매에 의해 드물게 발생하는 생체 변형입니다. CYP101D5와 다른 CYP101 계열 사이의 구조적 비교는 B/C 루프 방향의 교대가 CYP101D5의 기질 선호도를 변경하는 더 큰 활성 사이트를 생성했음을 나타냅니다. 이전 연구에서 B/C 루프가 작은 기질 인식의 원인일 수 있음을 보여주었지만, CYP101 제품군의 구조에서는 큰 기질에 대한 B/C 루프의 다른 방향이 표시되지 않았습니다.
CYP154C4는 스테로이드를 수산화시키는 것으로 잘 알려져 있으며, 이 외에도 약물로 사용되는 papaverine의 N-수산화반응을 촉매할 수 있었습니다. CYP154C4의 천연 산화환원 파트너는 알려지지 않았기 때문에 시험관 내 활동은 값비싼 다른 산화환원 파트너에 의존해 왔습니다. 여기에서 우리는 촉매 효율을 보여주는 산화환원 파트너에 융합된 단일 구성 요소 박테리아 생합성 CYP154C4의 생체 외 반응의 특성을 설명합니다. CYP154C4의 산화 환원 파트너는 구조 시뮬레이션, 분자 도킹 및 분자 역학 시뮬레이션 분석을 기반으로 선택되었습니다. 산화환원 파트너와 CYP 간의 분자 인식 및 상호작용에 관한 정보를 활용하여 Rhodococcus의 RhFRED를 선택하여 융합 시스템에 대한 대체 전자 전달 경로를 조사했습니다. CYP154C4는 기존의 16개 아미노산 링커 서열을 포함하여 RhFRED 유전자와 연결되었습니다. 융합 단백질에 의한 N-산화물의 생산은 CYP154C4-RhFRED가 자급자족 P450 효소임을 명백히 확인시켜 줍니다. 산소 결합 영역 T242E에서의 돌연변이는 효소의 퍼옥시게나제 활성을 증가시켰다. 반면 T242A는 papaverine의 N-산화 반응에서 중요하지만 알려지지 않은 메커니즘을 설명하는 퍼옥시게나제 활성에 영향을 미치지 않았습니다.
우리는 또한 여러 효소를 사용하여 화합물의 생체 변환을 수행했습니다. 우리는 스테로이드의 수산화 및 후속 당화를 위한 one-pot 시스템을 설계했습니다. 산화환원 파트너 Pdx/PdR 및 당전이효소 UGT-1과 함께 글루코스 공여체와 함께 스테로이드 수산화효소 CYP154C3를 사용하였다. C16 위치에서 수산화된 progesterone은 이어서 당화되었다. 기존의 progesterone에 비해서 수용성이 각각 2.74배, 51.36배 증가된 고용해성 수산화 progesterone과 progesterone 배당체를 얻었다. 우리는 또한 생체 내 수산화 반응과 naringenin의 후속 메틸화를 수행했습니다. 이를 위해, 산화환원 파트너 Pdx/PdR 및 O-메틸전이효소와 함께 CYP105A5를 갖는 대장균 컨소시엄을 사용하였다. 컨소시엄에서 두 모듈의 발현양이 높을수록 메틸전이효소 반응력이 높았고, homoeriodictyol과 hesperetin의 생산이 증가함을 알 수 있었다. 생체 변환 12시간 후, 기질의 70%가 메틸화된 생성물로 전환되었다.
최종적으로, 이 연구 작업은 P450 효소의 기질 유연성과 촉매 다양성을 설명합니다. 우리의 연구는 P450이 단백질 공학의 미래 적용에 의해 그들의 활동을 변경 및/또는 개선할 수 있는 좋은 후보가 될 수 있음을 보여주었습니다. 또한 단순 발효를 사용하여 one-pot 효소 반응 시스템과 전체 세포 생체 촉매에서 이러한 단백질을 적용하여 다른 접근 방식에 비해 더 저렴하고 확장하기 쉬운 가치 있는 파생물을 생산하는 방법을 조사했습니다.
The Cytochrome P450 monooxygenases (CYP or P450) are ubiquitous heme-thiolate proteins, catalyzing a wide range of reactions, including stereo-selective hydroxylation, epoxidation, N-oxidation, demethylation, N-, O-, and S-dealkylation, etc. and making them a potential biocatalyst for synthetic appl...
The Cytochrome P450 monooxygenases (CYP or P450) are ubiquitous heme-thiolate proteins, catalyzing a wide range of reactions, including stereo-selective hydroxylation, epoxidation, N-oxidation, demethylation, N-, O-, and S-dealkylation, etc. and making them a potential biocatalyst for synthetic applications. Bacterial P450 enzymes are typically cytosolic, water-soluble, and exhibit a high degree of stability, which makes them appealing for various biotechnological applications. This study focuses on the investigation of catalytic potential, functional and structural study of cytochrome P450, and their applications.
Steroids are ubiquitously available bioactive compounds possessing a wide range of therapeutic effects. The cytochrome P450 enzymes CYP154C3 from Streptomyces sp. W2061 (CYP154C3‐1) andsStreptomyces sp. KCCM40643 (CYP154C3‐2) were able to hydroxylate various steroids with high activity and selectivity using the heterologous redox partners’ putidaredoxin and putidaredoxin reductase exhibiting interesting product formation patterns. The characterization of the enzyme revealed good enzymatic activity with an optimal pH range of 7.0 - 7.8 and temperature range of 30 to 37°C. The major product observed was C16-hydroxylated and the kinetic profiles and patterns of the hydroxylated products obtained differed between the two enzymes. Oxidizing agents (diacetoxyiodo) benzene (PIDA) (3 mM) and hydrogen peroxide (H2O2) (65 mM) were also utilized as the surrogate redox partner. The oxidizing agents affected the product distribution pattern, influencing the CYP-catalyzed reaction. Additionally, CYP154C3s also demonstrated the steroid C–C bond cleavage. Therefore, CYP154C3s may be a good candidate to produce modified steroids for various biological uses.
The study on the CYP105A5 from Streptomyces sp. showed substrate flexibility with different flavonoids, catalyzing O-demethylation of biochanin A and regioselective C3'-hydroxylation of daidzein, genistein, and naringenin, and additional C8-hydroxylation for daidzein using heterologous redox partners putidaredoxin and putidaredoxin reductase. By rational design of substrate binding pocket based on the experimental data, homology modeling, and molecular docking analysis, we enhanced the product formation rate of flavonoids. The double mutant L100A/I302A and L100A/I408N exhibited greatly enhanced in vivo conversion rates for flavonoid hydroxylation. Especially, the mutant’s kcat/Km values increased by 1.68-fold and in vivo conversion rate by 2.57-fold for naringenin. Overall, our result might facilitate the potential use of CYP105A5 for future modification and application in whole-cell biocatalysts to produce valuable polyphenols.
CYP101D5 mediated hydroxylation of β-ionone and flavonoids; apigenin and naringenin, and the dehydrogenation of α-ionone was identified. To date, CYP101 family proteins have been well-known for the hydroxylation of small molecules, such as ionones and camphor. However, CYP101D5 showed uncommon features for both the substrates and catalysis. Particularly, the dehydrogenation of α-ionone is an entirely novel reaction for the CYP101D subfamily. Furthermore, CYP101D5 demonstrated the hydroxylation of larger molecules, such as flavonoid, which was never observed in the CYP101D family as it is the seldom occurring biotransformation reaction catalyzed by bacterial CYPs. The structural comparison of CYP101D5 with other CYP101 families indicated the alternation in orientation of the B/C loop’s generating the larger active site changing the substrate preference of CYP101D5. Although previous studies have shown that the small substrate recognition is facilitated through B/C loops, a different orientation of the B/C loop responsible for large substrates has not been observed in structures of the CYP101 family.
The CYP154C4 is well known for its activity to hydroxylate steroids. Beside hydroxylation, CYP154C4 was also able to catalyze the N-oxidation of the drug papaverine. Since the native redox partner of CYP154C4 remains unidentified, its in vitro activity has depended on the expensive surrogate redox partners. Mutation in the oxygen binding region T242E increased the peroxygenase activity of the enzyme. Whereas mutant T242A did not affected the peroxygenase activity illustrating the unknown mechanism that underlines the N-oxidation of papaverine. Here, we also described the in-vitro characterization of a bacterial P450 fused to the redox partner that demonstrates catalytic efficiency. The redox partner for CYP154C4 was selected based on the structural simulation, molecular docking, and molecular dynamics simulation analysis. Utilizing the information regarding molecular recognition and interactions between the redox partner and CYP, RhFRED from Rhodococcus was selected to further investigate an alternative electron-transfer pathway for the fusion system. CYP154C4 was fused to the RhFRED gene, including the 16 amino acid native linker sequence. The production of Noxide product by fusion protein unambiguously confirms that CYP154C4-RhFRED is a chimeric self-sufficient P450 enzyme.
We also carried out the biotransformation of compounds using multiple enzymes. We designed a one-pot system for the hydroxylation and subsequent glucosylation of steroids. Steroid hydroxylase CYP154C3, accompanied by redox partner Pdx/PdR and glycosyltransferase UGT1 along with glucose donor, were utilized. Progesterone hydroxylated at C16 position was subsequently glucosylated. The highly soluble hydroxylated progesterone and progesterone glucoside were obtained with a 2.74 and 51.36-fold increase in water solubility compared to that of progesterone, respectively. We also carried out in-vivo hydroxylation and subsequent methylation of naringenin. E. coli consortium having CYP105A5 along with redox partner Pdx/PdR and O-methyltransferase were utilized for this purpose. When the ratio of cell density of the two modules in the consortium changed to higher methyltransferase ratio, increase in the production of homoeriodictyol and hesperetin was observed from naringenin. After 12 hr of biotransformation, 70% of the substrates were converted to methylated products.
Taken together, this research work describes the substrate flexibility and catalytic promiscuity of the P450 enzymes. Our study showed that they can be a good candidate to change and/or improve their activity by the future application of protein engineering. We also explored the application of these proteins in the one-pot enzyme reaction system and in whole-cell biocatalysts using simple fermentation to produce valuable derivatives, that are cheaper and easier to scale-up, compared to other approaches.
The Cytochrome P450 monooxygenases (CYP or P450) are ubiquitous heme-thiolate proteins, catalyzing a wide range of reactions, including stereo-selective hydroxylation, epoxidation, N-oxidation, demethylation, N-, O-, and S-dealkylation, etc. and making them a potential biocatalyst for synthetic applications. Bacterial P450 enzymes are typically cytosolic, water-soluble, and exhibit a high degree of stability, which makes them appealing for various biotechnological applications. This study focuses on the investigation of catalytic potential, functional and structural study of cytochrome P450, and their applications.
Steroids are ubiquitously available bioactive compounds possessing a wide range of therapeutic effects. The cytochrome P450 enzymes CYP154C3 from Streptomyces sp. W2061 (CYP154C3‐1) andsStreptomyces sp. KCCM40643 (CYP154C3‐2) were able to hydroxylate various steroids with high activity and selectivity using the heterologous redox partners’ putidaredoxin and putidaredoxin reductase exhibiting interesting product formation patterns. The characterization of the enzyme revealed good enzymatic activity with an optimal pH range of 7.0 - 7.8 and temperature range of 30 to 37°C. The major product observed was C16-hydroxylated and the kinetic profiles and patterns of the hydroxylated products obtained differed between the two enzymes. Oxidizing agents (diacetoxyiodo) benzene (PIDA) (3 mM) and hydrogen peroxide (H2O2) (65 mM) were also utilized as the surrogate redox partner. The oxidizing agents affected the product distribution pattern, influencing the CYP-catalyzed reaction. Additionally, CYP154C3s also demonstrated the steroid C–C bond cleavage. Therefore, CYP154C3s may be a good candidate to produce modified steroids for various biological uses.
The study on the CYP105A5 from Streptomyces sp. showed substrate flexibility with different flavonoids, catalyzing O-demethylation of biochanin A and regioselective C3'-hydroxylation of daidzein, genistein, and naringenin, and additional C8-hydroxylation for daidzein using heterologous redox partners putidaredoxin and putidaredoxin reductase. By rational design of substrate binding pocket based on the experimental data, homology modeling, and molecular docking analysis, we enhanced the product formation rate of flavonoids. The double mutant L100A/I302A and L100A/I408N exhibited greatly enhanced in vivo conversion rates for flavonoid hydroxylation. Especially, the mutant’s kcat/Km values increased by 1.68-fold and in vivo conversion rate by 2.57-fold for naringenin. Overall, our result might facilitate the potential use of CYP105A5 for future modification and application in whole-cell biocatalysts to produce valuable polyphenols.
CYP101D5 mediated hydroxylation of β-ionone and flavonoids; apigenin and naringenin, and the dehydrogenation of α-ionone was identified. To date, CYP101 family proteins have been well-known for the hydroxylation of small molecules, such as ionones and camphor. However, CYP101D5 showed uncommon features for both the substrates and catalysis. Particularly, the dehydrogenation of α-ionone is an entirely novel reaction for the CYP101D subfamily. Furthermore, CYP101D5 demonstrated the hydroxylation of larger molecules, such as flavonoid, which was never observed in the CYP101D family as it is the seldom occurring biotransformation reaction catalyzed by bacterial CYPs. The structural comparison of CYP101D5 with other CYP101 families indicated the alternation in orientation of the B/C loop’s generating the larger active site changing the substrate preference of CYP101D5. Although previous studies have shown that the small substrate recognition is facilitated through B/C loops, a different orientation of the B/C loop responsible for large substrates has not been observed in structures of the CYP101 family.
The CYP154C4 is well known for its activity to hydroxylate steroids. Beside hydroxylation, CYP154C4 was also able to catalyze the N-oxidation of the drug papaverine. Since the native redox partner of CYP154C4 remains unidentified, its in vitro activity has depended on the expensive surrogate redox partners. Mutation in the oxygen binding region T242E increased the peroxygenase activity of the enzyme. Whereas mutant T242A did not affected the peroxygenase activity illustrating the unknown mechanism that underlines the N-oxidation of papaverine. Here, we also described the in-vitro characterization of a bacterial P450 fused to the redox partner that demonstrates catalytic efficiency. The redox partner for CYP154C4 was selected based on the structural simulation, molecular docking, and molecular dynamics simulation analysis. Utilizing the information regarding molecular recognition and interactions between the redox partner and CYP, RhFRED from Rhodococcus was selected to further investigate an alternative electron-transfer pathway for the fusion system. CYP154C4 was fused to the RhFRED gene, including the 16 amino acid native linker sequence. The production of Noxide product by fusion protein unambiguously confirms that CYP154C4-RhFRED is a chimeric self-sufficient P450 enzyme.
We also carried out the biotransformation of compounds using multiple enzymes. We designed a one-pot system for the hydroxylation and subsequent glucosylation of steroids. Steroid hydroxylase CYP154C3, accompanied by redox partner Pdx/PdR and glycosyltransferase UGT1 along with glucose donor, were utilized. Progesterone hydroxylated at C16 position was subsequently glucosylated. The highly soluble hydroxylated progesterone and progesterone glucoside were obtained with a 2.74 and 51.36-fold increase in water solubility compared to that of progesterone, respectively. We also carried out in-vivo hydroxylation and subsequent methylation of naringenin. E. coli consortium having CYP105A5 along with redox partner Pdx/PdR and O-methyltransferase were utilized for this purpose. When the ratio of cell density of the two modules in the consortium changed to higher methyltransferase ratio, increase in the production of homoeriodictyol and hesperetin was observed from naringenin. After 12 hr of biotransformation, 70% of the substrates were converted to methylated products.
Taken together, this research work describes the substrate flexibility and catalytic promiscuity of the P450 enzymes. Our study showed that they can be a good candidate to change and/or improve their activity by the future application of protein engineering. We also explored the application of these proteins in the one-pot enzyme reaction system and in whole-cell biocatalysts using simple fermentation to produce valuable derivatives, that are cheaper and easier to scale-up, compared to other approaches.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.