나고야의정서-대응 장관면역 조절 식품 및 건강기능식품의 소재를 개발하고자 병풀(Centella asiatica; CA)로부터 장관면역 조절 활성을 평가하였다. 재배환경과 추출 방법에 따라 각기 다르게 조제된 병풀 추출물 중 토경재배 병풀 착즙액은 100 μg/mL의 농도에서 유의적인 독성은 나타나지 않았으며, IL-6, IL-8 및 ...
나고야의정서-대응 장관면역 조절 식품 및 건강기능식품의 소재를 개발하고자 병풀(Centella asiatica; CA)로부터 장관면역 조절 활성을 평가하였다. 재배환경과 추출 방법에 따라 각기 다르게 조제된 병풀 추출물 중 토경재배 병풀 착즙액은 100 μg/mL의 농도에서 유의적인 독성은 나타나지 않았으며, IL-6, IL-8 및 MCP-1 생성능을 확인한 결과, 가장 우수한 장관면역 조절 활성을 나타냈다. 하지만, 토경재배 열수추출물 또한 100 μg/mL의 농도에서 유의적인 활성이 나타났으며, 50~100 μg/mL의 농도 범위에서 재평가한 결과, 우수한 장관면역 조절 활성이 확인되었다. 본 연구에서는 원료 수급 및 제조 공정 등을 포함한 산업적 활용 가능성을 토대로 토경 재배 열수추출물을 장관면역 조절 활성화 소재로 선정하였다. Balb/c 마우스를 이용한 장관면역 조절 활성을 평가하기 위해 dextran sulfate sodium(DSS)-유도 염증성 장 질환 모델을 구축하여 병풀 열수추출물(CA-HE)의 염증성 장 질환 예방/개선 효능을 확인하고자 하였다. CA-HE의 경구투여에 따른 안전성은 마우스의 주요 장기(심장, 신장 및 간)의 무게를 측정함으로써 평가되었으며, 심장 및 신장의 무게는 염증 유도군(DSS) 대비 유의적인 차이를 나타내지 않았지만, 간의 경우 정상 대조군(NT)에 비해 무게가 감소하였지만, 시료의 경구투여는 간의 무게를 증가시키는 것으로 확인되었다. 따라서 CA-HE의 3주간의 경구투여는 내약성이 좋고 안전한 것으로 확인되었다. 이후, 염증성 장 질환의 주요 임상증상을 평가하였으며, CA-HE의 경구투여는 농도-의존적으로 체중 감소, 질병 활동성 지표(disease activity index; DAI), 대장 단축 및 비장 비대를 개선하였다. 마우스의 대장 조직을 이용하여 친염증 및 항염증성 인자의 함량을 확인하기 위해 ELISA법을 이용하여 분석한 결과, CA-HE의 투여는 염증유도군 대비 친염증성 사이토카인/케모카인(IL-6, IL-12, MCP-1, TNF-α 및 MPO)의 함량을 감소시킨 반면, 항염증성 사이토카인(IL-4 및 IL-10)의 함량을 증가시키는 것으로 확인되었다. 또한, 마우스의 분변 및 맹장에서 단쇄지방산(short chain fatty acids; SCFAs)함량을 분석한 결과, 염증 유도군 대비 농도-의존적인 SCFAs의 증가를 확인할 수 있었다. 결과적으로, CA-HE의 경구투여는 염증성 장 질환에 대해 사이토카인/케모카인의 변화, SCFAs의 증가 등을 통해 염증성 장 질환에 대한 예방/개선 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. CA-HE의 활성 성분을 규명하기 위해 주정침전을 통해 조다당 획분(crude polysaccharide; CA-CP) 및 저분자 획분(low molecular weight; CA-L)를 분리하여 장관면역 조절 활성을 평가한 결과, 50~1000 μg/mL의 농도 범위에서 통계적으로 유의한 세포독성을 나타나지 않았으며, CA-CP가 CA-HE 및 CA-L보다 우수한 IL-6, IL-8 및 MCP-1 억제활성을 나타냈다. CA-CP는 산성당 65.0%, 중성당 20.4%, 단백질 5.2% 및 폴리페놀 8.6%를 포함하며 주로 GalA(69.2%), Gal(12.6%), Ara(7.3%) 및 Rha(5.1%)를 포함하는 고분자의 펙틴 다당류로 추정되었다. 이후, CA-CP를 endo-polygalacturonase를 처리하여 CA-PE를 조제하였으며, 이를 Sephadex-G100을 이용하여 분자량에 따라 분리 및 정제를 진행하였다. CA-PE로부터 분획된 CA-PE-I, -II, -III 및 –IV 획분의 장관면역 조절 활성을 재평가한 결과, CA-PE-IV 획분이 장관면역 조절 활성 본체임을 확인할 수 있었으며, CA-PE-IV 획분은 2.5 kDa의 산성당 56.7%와 중성당 31.4%를 주로 함유하고 GalA(68.4%), Rha(8.9%), Gal(8.4%), Ara(5.6%) 및 GlcA(4.6%)를 구성당으로 가진 GalA가 풍부한 다당체임을 확인할 수 있었다. 2.5 KDa의 분자량을 가진 CA-HE 유래 활성 획분 CA-PE-IV는 7개의 구성당과 19개의 주요 결합양식으로 구성된 다당으로 확인되었다. 또한, CA-PE-IV는 endo-PGase의 처리에 의해 펙틴의 homogalacturonan(HG)이 가수분해되어 분리된 RG-II에 소량의 HG와 RG-I이 결합되어 있는 다당체임을 추정할 수 있었다. 활성 다당 CA-PE-IV의 장관면역 활성 조절 기작을 확인하고자, IL-1β-유도 Caco-2 세포에서 IL-6, IL-8, MCP-1, COX-2 및 TNF-α의 mRNA 발현량을 분석한 결과, 시료 처리에 따라 농도-의존적으로 mRNA 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 장관면역 조절의 핵심 경로를 확인하고자, MAPK 및 NF-κB 경로를 분석한 결과, 시료 처리는 MAPK 및 NF-κB 경로의 인산화를 억제하였으며, MAPK 및 NF-κB의 전사인자인 p65 및 cjun의 핵 내로의 전이 또한 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, MAPK와 NF-κB 경로의 단백질을 차단하는 specific inhibitor을 처리하여 IL-6, IL-8 및 MCP-1의 생성능을 확인한 결과, IL-6 생성의 억제는 ERK, JNK 및 IκBα를 매개하는 것을 확인할 수 있었으며, IL-8 및 MCP-1 생성의 억제는 p38, ERK 및 JNK를 매개하는 것을 확인할 수 있었다. 더 나아가, CA-PE-IV의 처리는 IL-1R 리셉터의 발현량을 감소시키는 것으로 확인되었다. 따라서 병풀 열수추출물 유래 장관면역 활성 본체 CA-PE-IV의 처리는 IL-1R 리셉터의 발현량을 감소시키고, MAPK 및 NF-κB의 인산화와 전이를 억제하며, mRNA 발현량을 감소시키고, 최종적으로 세포외로 분비되는 염증성 인자의 감소를 통해 장관면역 조절 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 병풀을 이용한 식품 및 건강기능 식품의 산업화를 위해 제품 표준화를 위한 지표물질을 분석하고자 하였으며, 이를 토대로 분석법 검증을 진행하였다. 트리테르페노이드 4종 madecassoside, asiaticoside, madecassic acid 및 asiatic acid를 분석한 결과, 함량, 피크의 분리도 등을 고려하여 최종 지표물질은 asiaticoside로 확립하였으며, 이후 분석법 검증을 진행하였으며 특이성, 직선성, 검출 한계, 정량한계, 정밀성 및 정확성을 평가한 결과, 해당 분석법은 적합한 분석법임을 확인할 수 있었다. 이후, CA-HE를 함유한 장관면역 조절 음료를 조제하였으며, 이들의 장관면역 조절 활성과 제품 표준화를 위한 지표물질의 함량을 분석하였다. CA-HE 함유 음료는 Caco-2 세포주에 대해 유의적인 독성을 나타내지 않았으며, IL-6, IL-8 및 MCP-1의 생성량을 유의적으로 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, HPLC-DAD를 이용한 지표물질의 함량을 분석한 결과, asiaticoside만이 정량한계 이상을 초과하는 함량이 검출되었으며 지표물질로서 활용 가능성을 입증하였다. 본 연구결과를 종합해보면, 병풀 열수추출물(CA-HE)는 장관면역 조절에 효과적인 소재임을 확인할 수 있었으며, CA-HE의 최종 활성 본체인 CA-PE-IV는 2.5 kDa의 GalA가 풍부한 다당체임을 확인할 수 있었으며, IL-1R receptor를 통해 MAPK 및 NF-κB 신호전달 경로를 경유하여 IL-6, IL-8 및 MCP-1의 분비량을 감소시켜 장관면역 조절 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 제품 표준화를 위한 asiaticoside가 지표물질로 적합한 것을 확인할 수 있었으며, CA-HE가 함유된 병풀 음료는 효과적인 장관면역 조절 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 병풀은 나고야 의정서-대응 장관면역 조절 활성 기능을 가진 식품 및 건강기능식품의 소재의 기초자료로 활용 가능할 것으로 판단되며, 생물소재의 국산화 및 산업화에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
나고야의정서-대응 장관면역 조절 식품 및 건강기능식품의 소재를 개발하고자 병풀(Centella asiatica; CA)로부터 장관면역 조절 활성을 평가하였다. 재배환경과 추출 방법에 따라 각기 다르게 조제된 병풀 추출물 중 토경재배 병풀 착즙액은 100 μg/mL의 농도에서 유의적인 독성은 나타나지 않았으며, IL-6, IL-8 및 MCP-1 생성능을 확인한 결과, 가장 우수한 장관면역 조절 활성을 나타냈다. 하지만, 토경재배 열수추출물 또한 100 μg/mL의 농도에서 유의적인 활성이 나타났으며, 50~100 μg/mL의 농도 범위에서 재평가한 결과, 우수한 장관면역 조절 활성이 확인되었다. 본 연구에서는 원료 수급 및 제조 공정 등을 포함한 산업적 활용 가능성을 토대로 토경 재배 열수추출물을 장관면역 조절 활성화 소재로 선정하였다. Balb/c 마우스를 이용한 장관면역 조절 활성을 평가하기 위해 dextran sulfate sodium(DSS)-유도 염증성 장 질환 모델을 구축하여 병풀 열수추출물(CA-HE)의 염증성 장 질환 예방/개선 효능을 확인하고자 하였다. CA-HE의 경구투여에 따른 안전성은 마우스의 주요 장기(심장, 신장 및 간)의 무게를 측정함으로써 평가되었으며, 심장 및 신장의 무게는 염증 유도군(DSS) 대비 유의적인 차이를 나타내지 않았지만, 간의 경우 정상 대조군(NT)에 비해 무게가 감소하였지만, 시료의 경구투여는 간의 무게를 증가시키는 것으로 확인되었다. 따라서 CA-HE의 3주간의 경구투여는 내약성이 좋고 안전한 것으로 확인되었다. 이후, 염증성 장 질환의 주요 임상증상을 평가하였으며, CA-HE의 경구투여는 농도-의존적으로 체중 감소, 질병 활동성 지표(disease activity index; DAI), 대장 단축 및 비장 비대를 개선하였다. 마우스의 대장 조직을 이용하여 친염증 및 항염증성 인자의 함량을 확인하기 위해 ELISA법을 이용하여 분석한 결과, CA-HE의 투여는 염증유도군 대비 친염증성 사이토카인/케모카인(IL-6, IL-12, MCP-1, TNF-α 및 MPO)의 함량을 감소시킨 반면, 항염증성 사이토카인(IL-4 및 IL-10)의 함량을 증가시키는 것으로 확인되었다. 또한, 마우스의 분변 및 맹장에서 단쇄지방산(short chain fatty acids; SCFAs)함량을 분석한 결과, 염증 유도군 대비 농도-의존적인 SCFAs의 증가를 확인할 수 있었다. 결과적으로, CA-HE의 경구투여는 염증성 장 질환에 대해 사이토카인/케모카인의 변화, SCFAs의 증가 등을 통해 염증성 장 질환에 대한 예방/개선 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. CA-HE의 활성 성분을 규명하기 위해 주정침전을 통해 조다당 획분(crude polysaccharide; CA-CP) 및 저분자 획분(low molecular weight; CA-L)를 분리하여 장관면역 조절 활성을 평가한 결과, 50~1000 μg/mL의 농도 범위에서 통계적으로 유의한 세포독성을 나타나지 않았으며, CA-CP가 CA-HE 및 CA-L보다 우수한 IL-6, IL-8 및 MCP-1 억제활성을 나타냈다. CA-CP는 산성당 65.0%, 중성당 20.4%, 단백질 5.2% 및 폴리페놀 8.6%를 포함하며 주로 GalA(69.2%), Gal(12.6%), Ara(7.3%) 및 Rha(5.1%)를 포함하는 고분자의 펙틴 다당류로 추정되었다. 이후, CA-CP를 endo-polygalacturonase를 처리하여 CA-PE를 조제하였으며, 이를 Sephadex-G100을 이용하여 분자량에 따라 분리 및 정제를 진행하였다. CA-PE로부터 분획된 CA-PE-I, -II, -III 및 –IV 획분의 장관면역 조절 활성을 재평가한 결과, CA-PE-IV 획분이 장관면역 조절 활성 본체임을 확인할 수 있었으며, CA-PE-IV 획분은 2.5 kDa의 산성당 56.7%와 중성당 31.4%를 주로 함유하고 GalA(68.4%), Rha(8.9%), Gal(8.4%), Ara(5.6%) 및 GlcA(4.6%)를 구성당으로 가진 GalA가 풍부한 다당체임을 확인할 수 있었다. 2.5 KDa의 분자량을 가진 CA-HE 유래 활성 획분 CA-PE-IV는 7개의 구성당과 19개의 주요 결합양식으로 구성된 다당으로 확인되었다. 또한, CA-PE-IV는 endo-PGase의 처리에 의해 펙틴의 homogalacturonan(HG)이 가수분해되어 분리된 RG-II에 소량의 HG와 RG-I이 결합되어 있는 다당체임을 추정할 수 있었다. 활성 다당 CA-PE-IV의 장관면역 활성 조절 기작을 확인하고자, IL-1β-유도 Caco-2 세포에서 IL-6, IL-8, MCP-1, COX-2 및 TNF-α의 mRNA 발현량을 분석한 결과, 시료 처리에 따라 농도-의존적으로 mRNA 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 장관면역 조절의 핵심 경로를 확인하고자, MAPK 및 NF-κB 경로를 분석한 결과, 시료 처리는 MAPK 및 NF-κB 경로의 인산화를 억제하였으며, MAPK 및 NF-κB의 전사인자인 p65 및 cjun의 핵 내로의 전이 또한 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, MAPK와 NF-κB 경로의 단백질을 차단하는 specific inhibitor을 처리하여 IL-6, IL-8 및 MCP-1의 생성능을 확인한 결과, IL-6 생성의 억제는 ERK, JNK 및 IκBα를 매개하는 것을 확인할 수 있었으며, IL-8 및 MCP-1 생성의 억제는 p38, ERK 및 JNK를 매개하는 것을 확인할 수 있었다. 더 나아가, CA-PE-IV의 처리는 IL-1R 리셉터의 발현량을 감소시키는 것으로 확인되었다. 따라서 병풀 열수추출물 유래 장관면역 활성 본체 CA-PE-IV의 처리는 IL-1R 리셉터의 발현량을 감소시키고, MAPK 및 NF-κB의 인산화와 전이를 억제하며, mRNA 발현량을 감소시키고, 최종적으로 세포외로 분비되는 염증성 인자의 감소를 통해 장관면역 조절 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 병풀을 이용한 식품 및 건강기능 식품의 산업화를 위해 제품 표준화를 위한 지표물질을 분석하고자 하였으며, 이를 토대로 분석법 검증을 진행하였다. 트리테르페노이드 4종 madecassoside, asiaticoside, madecassic acid 및 asiatic acid를 분석한 결과, 함량, 피크의 분리도 등을 고려하여 최종 지표물질은 asiaticoside로 확립하였으며, 이후 분석법 검증을 진행하였으며 특이성, 직선성, 검출 한계, 정량한계, 정밀성 및 정확성을 평가한 결과, 해당 분석법은 적합한 분석법임을 확인할 수 있었다. 이후, CA-HE를 함유한 장관면역 조절 음료를 조제하였으며, 이들의 장관면역 조절 활성과 제품 표준화를 위한 지표물질의 함량을 분석하였다. CA-HE 함유 음료는 Caco-2 세포주에 대해 유의적인 독성을 나타내지 않았으며, IL-6, IL-8 및 MCP-1의 생성량을 유의적으로 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, HPLC-DAD를 이용한 지표물질의 함량을 분석한 결과, asiaticoside만이 정량한계 이상을 초과하는 함량이 검출되었으며 지표물질로서 활용 가능성을 입증하였다. 본 연구결과를 종합해보면, 병풀 열수추출물(CA-HE)는 장관면역 조절에 효과적인 소재임을 확인할 수 있었으며, CA-HE의 최종 활성 본체인 CA-PE-IV는 2.5 kDa의 GalA가 풍부한 다당체임을 확인할 수 있었으며, IL-1R receptor를 통해 MAPK 및 NF-κB 신호전달 경로를 경유하여 IL-6, IL-8 및 MCP-1의 분비량을 감소시켜 장관면역 조절 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 제품 표준화를 위한 asiaticoside가 지표물질로 적합한 것을 확인할 수 있었으며, CA-HE가 함유된 병풀 음료는 효과적인 장관면역 조절 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 병풀은 나고야 의정서-대응 장관면역 조절 활성 기능을 가진 식품 및 건강기능식품의 소재의 기초자료로 활용 가능할 것으로 판단되며, 생물소재의 국산화 및 산업화에 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
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