HPLC-ELSD를 이용한 레시틴의 포스파티딜콜린 분석: 유효성 확인, 측정불확도 추정 및 HPLC-RID와 비교 Quantification Analysis of Phosphatidylcholine in Lecithin through HPLC-Evaporative Light Scattering Detector: Method verification, Estimation of Measurement Uncertainty and Comparison with HPLC-RID원문보기
레시틴은 동식물의 모든 생체막에 존재하는 인지질로서 콜레스테롤 수치를 개선시키는데 도움을 주고 항산화 작용을 하는 등 다양한 기능성을 제공하는 물질이다. 이러한 특성 때문에 레시틴은 여러 산업에서 지속적으로 사용되며 그 이용성은 날로 증가하고 있다. 이에 따라, 본 연구는 레시틴의 주성분인 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine, PC)을 측정하고 정량하기 위해 HPLC와 ELSD (Evaporative Light Scattering ...
레시틴은 동식물의 모든 생체막에 존재하는 인지질로서 콜레스테롤 수치를 개선시키는데 도움을 주고 항산화 작용을 하는 등 다양한 기능성을 제공하는 물질이다. 이러한 특성 때문에 레시틴은 여러 산업에서 지속적으로 사용되며 그 이용성은 날로 증가하고 있다. 이에 따라, 본 연구는 레시틴의 주성분인 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine, PC)을 측정하고 정량하기 위해 HPLC와 ELSD (Evaporative Light Scattering Detector)를 사용하였다. 또한, 건강기능식품공전에 제시된 레시틴의 포스파티딜콜린 분석법 중 제3법인 HPLC-RID를 이용한 시험 방법과 비교하여 유의미한 개선을 도출하고자 하였으며 측정불확도 추정을 통해 신뢰성을 확보하였다. 포스파티딜콜린은 클로로포름과 메탄올(1:1, v/v) 용액을 이용하여 추출한 후 실리카 컬럼을 사용하여 분리하였고, 유속은 0.8 mL/min, 주입량은 10 µL로 설정하였다. 증발 광산란 검출기의 기화 온도와 Nebulizer는 40 °C로, 가스 압력은 60 ~ 100 psi로 설정하였다. 본 연구결과에 따른 분석법 검증에서 대두 PC의 경우, 특이성 확보하였으며 직선성은 25 – 500 µg/mL에서 R2 > 0.994 9, LOD 및 LOQ는 22.64 µg/g, 68.60 µg/g이었다. 정확도는 98~104 %, 반복성 및 중간 정밀성은 98.1~104.0 %, 99.3~104.3 %로 나타났다. 난황 PC의 경우, 특이성을 확보하였으며 직선성은 50 – 1000 µg/mL에서 R2 > 0.997 0이었다. LOD와 LOQ는 각각 32.57 µg/g, 98.68 µg/g, 정확도는 99~104 %, 반복성과 중간정밀성은 각각 100.4~102.2 %, 100.4~103.6 %로 나타났다. 두 개의 레시틴 샘플에 대한 측정 불확도를 추정한 결과, 대두 레시틴의 경우 (120.1 ± 12.0) mg/g, 난황 레시틴의 경우 (406.6 ± 37.0) mg/g였으며 모두 CODEX 기준을 충족하였다. 분석법 비교를 위해 HPLC-RID 시험법 검증을 수행한 결과, 크로마토그램에서 특이성을 확보하였고, 직선성은 1 000~10 000 µg/mL에서 대두 PC와 난황 PC 각각 R2 > 0.998 4, R2 > 0.997 9였다. LOD와 LOQ는 대두 PC의 경우 226.31, 685.78 µg/g, 난황 PC는 112.40, 340.61 µg/g였다. 정확도는 각각 99~103 %, 99~104 % 이며 반복성 및 중간정밀도는 대두 PC 및 난황 PC 각각100.3~102.8 %, 100.4~101.7 % 로 나타났다. 포스파티딜콜린을 측정하기 위해 HPLC의 두 가지 검출기를 비교 분석한 결과, ELS 검출기를 사용하였을 때 약 3~10배 가량 낮은 LOD, LOQ를 얻어 더 낮은 농도에서도 유효성분을 검출할 수 있었으며 선택성 또한 높은 것으로 확인하였다. 본 연구는 레시틴 중 포스파티딜콜린에 대한 시험 규격과 이용성이 다양한 만큼 향후 증기광산란 검출기를 이용하여 여러 인지질을 동시 분석하는 등 확장에 기초자료로 활용될 것으로 기대된다.
레시틴은 동식물의 모든 생체막에 존재하는 인지질로서 콜레스테롤 수치를 개선시키는데 도움을 주고 항산화 작용을 하는 등 다양한 기능성을 제공하는 물질이다. 이러한 특성 때문에 레시틴은 여러 산업에서 지속적으로 사용되며 그 이용성은 날로 증가하고 있다. 이에 따라, 본 연구는 레시틴의 주성분인 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine, PC)을 측정하고 정량하기 위해 HPLC와 ELSD (Evaporative Light Scattering Detector)를 사용하였다. 또한, 건강기능식품공전에 제시된 레시틴의 포스파티딜콜린 분석법 중 제3법인 HPLC-RID를 이용한 시험 방법과 비교하여 유의미한 개선을 도출하고자 하였으며 측정불확도 추정을 통해 신뢰성을 확보하였다. 포스파티딜콜린은 클로로포름과 메탄올(1:1, v/v) 용액을 이용하여 추출한 후 실리카 컬럼을 사용하여 분리하였고, 유속은 0.8 mL/min, 주입량은 10 µL로 설정하였다. 증발 광산란 검출기의 기화 온도와 Nebulizer는 40 °C로, 가스 압력은 60 ~ 100 psi로 설정하였다. 본 연구결과에 따른 분석법 검증에서 대두 PC의 경우, 특이성 확보하였으며 직선성은 25 – 500 µg/mL에서 R2 > 0.994 9, LOD 및 LOQ는 22.64 µg/g, 68.60 µg/g이었다. 정확도는 98~104 %, 반복성 및 중간 정밀성은 98.1~104.0 %, 99.3~104.3 %로 나타났다. 난황 PC의 경우, 특이성을 확보하였으며 직선성은 50 – 1000 µg/mL에서 R2 > 0.997 0이었다. LOD와 LOQ는 각각 32.57 µg/g, 98.68 µg/g, 정확도는 99~104 %, 반복성과 중간정밀성은 각각 100.4~102.2 %, 100.4~103.6 %로 나타났다. 두 개의 레시틴 샘플에 대한 측정 불확도를 추정한 결과, 대두 레시틴의 경우 (120.1 ± 12.0) mg/g, 난황 레시틴의 경우 (406.6 ± 37.0) mg/g였으며 모두 CODEX 기준을 충족하였다. 분석법 비교를 위해 HPLC-RID 시험법 검증을 수행한 결과, 크로마토그램에서 특이성을 확보하였고, 직선성은 1 000~10 000 µg/mL에서 대두 PC와 난황 PC 각각 R2 > 0.998 4, R2 > 0.997 9였다. LOD와 LOQ는 대두 PC의 경우 226.31, 685.78 µg/g, 난황 PC는 112.40, 340.61 µg/g였다. 정확도는 각각 99~103 %, 99~104 % 이며 반복성 및 중간정밀도는 대두 PC 및 난황 PC 각각100.3~102.8 %, 100.4~101.7 % 로 나타났다. 포스파티딜콜린을 측정하기 위해 HPLC의 두 가지 검출기를 비교 분석한 결과, ELS 검출기를 사용하였을 때 약 3~10배 가량 낮은 LOD, LOQ를 얻어 더 낮은 농도에서도 유효성분을 검출할 수 있었으며 선택성 또한 높은 것으로 확인하였다. 본 연구는 레시틴 중 포스파티딜콜린에 대한 시험 규격과 이용성이 다양한 만큼 향후 증기광산란 검출기를 이용하여 여러 인지질을 동시 분석하는 등 확장에 기초자료로 활용될 것으로 기대된다.
Lecithin is a phospholipid present in all biological membranes both plants and animals, and is a multifunctional substance that provides various benefits such as helping to improve cholesterol and acting as an antioxidant. In this study, HPLC-ELSD (Evaporative Light-Scattering Detector) was used...
Lecithin is a phospholipid present in all biological membranes both plants and animals, and is a multifunctional substance that provides various benefits such as helping to improve cholesterol and acting as an antioxidant. In this study, HPLC-ELSD (Evaporative Light-Scattering Detector) was used to determine the phosphatidylcholine which is the main component of Lecithin; verified the method, and estimated measurement uncertainty to derive a significant improvement compared to method No. 3 HPLC-RID presented in Health Functional Food Code. The samples were chosen soy lecithin, which is a vegetable, and egg yolk lecithin, which is an animal, depending on the raw materials as functional foods. Phosphatidylcholine was extracted using a chloroform and methanol (5:5, v/v) solution and then analyzed with gradient elution consisting of chloroform, chloroform: methanol (7:3, v/v), and chloroform: methanol: water: ammonia (4.5:4.5:0.95:0.05, v/v) through the analytical silica column by HPLC with Evaporative Light-Scattering Detector. The flow rate was 0.8 mL/min, injection volume was 10 L. The evaporator temperature and nebulizer of the ELS detector were set at 40 °C, and the gas flow was 60 - 100 psi. For the method verification for PC (from soy), the specificity was satisfied, and linearity for the calibration curve was 25 – 500 µg/mL, and R2 was 0.994 9. The LOD and LOQ were 22.64 µg/g, and 68.60 µg/g respectively. The average recovery rate for accuracy was 98 ~104 %, repeatability, and inter-precision were 98.1 ~ 104.0 %, and 99.3 ~ 104.3 % respectively. For the method verification for PC (from egg yolk), the specificity was satisfied as well, and the linearity for the calibration curve was 50 – 1000 µg/mL, and R2 was 0.997 0. LOD and LOQ were 32.57 µg/g, and 98.68 µg/g respectively. The average recovery rate for accuracy was 99 ~ 104 %, repeatability, and inter-precision were 100.4 ~ 102.2 % and 100.4 ~ 103.6 %. The estimated measurement uncertainty for two lecithin samples was (120.1 ± 12.0) mg/g for soy lecithin, and (406.6 ± 37.0) mg/g for egg lecithin which all met the CODEX standard. The method validation of HPLC-RID for comparison to the ELS detector was conducted. The calibration curve was 1000 ~ 10 000 µg/mL, and the R2 for linearity was 0.998 4, and 0.997 9 for each soy and egg yolk respectively. LOD and LOQ were 226.31, 685.78 µg/g for PC from soy, and 112.40, 340.61 µg/g for PC from egg yolk. Accuracy was 99 ~103 % (soy PC), and 99 ~ 104 % (egg yolk PC). The repeatability and intermediate precision were 100.3 % - 102.8 % (soy PC), and 100.4 % - 101.7 % (egg yolk PC). The result compared to the two HPLC analysis methods to determine the phosphatidylcholine, through the ELS detector was able to obtain concentration values in which the detection limit and quantitation limit were lower by about 3 - 10 %. Ultimately, this study has shown to detect lower concentrations significantly than the RI detector and increase the selectivity of the chromatogram when the HPLC-ELS detector was used. Thus, it was expected to be expanded to quantify other components of phospholipids in the future in this method as much as the test specifications for phosphatidylcholine among lecithin are diverse.
Lecithin is a phospholipid present in all biological membranes both plants and animals, and is a multifunctional substance that provides various benefits such as helping to improve cholesterol and acting as an antioxidant. In this study, HPLC-ELSD (Evaporative Light-Scattering Detector) was used to determine the phosphatidylcholine which is the main component of Lecithin; verified the method, and estimated measurement uncertainty to derive a significant improvement compared to method No. 3 HPLC-RID presented in Health Functional Food Code. The samples were chosen soy lecithin, which is a vegetable, and egg yolk lecithin, which is an animal, depending on the raw materials as functional foods. Phosphatidylcholine was extracted using a chloroform and methanol (5:5, v/v) solution and then analyzed with gradient elution consisting of chloroform, chloroform: methanol (7:3, v/v), and chloroform: methanol: water: ammonia (4.5:4.5:0.95:0.05, v/v) through the analytical silica column by HPLC with Evaporative Light-Scattering Detector. The flow rate was 0.8 mL/min, injection volume was 10 L. The evaporator temperature and nebulizer of the ELS detector were set at 40 °C, and the gas flow was 60 - 100 psi. For the method verification for PC (from soy), the specificity was satisfied, and linearity for the calibration curve was 25 – 500 µg/mL, and R2 was 0.994 9. The LOD and LOQ were 22.64 µg/g, and 68.60 µg/g respectively. The average recovery rate for accuracy was 98 ~104 %, repeatability, and inter-precision were 98.1 ~ 104.0 %, and 99.3 ~ 104.3 % respectively. For the method verification for PC (from egg yolk), the specificity was satisfied as well, and the linearity for the calibration curve was 50 – 1000 µg/mL, and R2 was 0.997 0. LOD and LOQ were 32.57 µg/g, and 98.68 µg/g respectively. The average recovery rate for accuracy was 99 ~ 104 %, repeatability, and inter-precision were 100.4 ~ 102.2 % and 100.4 ~ 103.6 %. The estimated measurement uncertainty for two lecithin samples was (120.1 ± 12.0) mg/g for soy lecithin, and (406.6 ± 37.0) mg/g for egg lecithin which all met the CODEX standard. The method validation of HPLC-RID for comparison to the ELS detector was conducted. The calibration curve was 1000 ~ 10 000 µg/mL, and the R2 for linearity was 0.998 4, and 0.997 9 for each soy and egg yolk respectively. LOD and LOQ were 226.31, 685.78 µg/g for PC from soy, and 112.40, 340.61 µg/g for PC from egg yolk. Accuracy was 99 ~103 % (soy PC), and 99 ~ 104 % (egg yolk PC). The repeatability and intermediate precision were 100.3 % - 102.8 % (soy PC), and 100.4 % - 101.7 % (egg yolk PC). The result compared to the two HPLC analysis methods to determine the phosphatidylcholine, through the ELS detector was able to obtain concentration values in which the detection limit and quantitation limit were lower by about 3 - 10 %. Ultimately, this study has shown to detect lower concentrations significantly than the RI detector and increase the selectivity of the chromatogram when the HPLC-ELS detector was used. Thus, it was expected to be expanded to quantify other components of phospholipids in the future in this method as much as the test specifications for phosphatidylcholine among lecithin are diverse.
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