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문제 정의
- 그러나 대부분의 불면증 환자나 치료자들은 수면제사용에 거부감과 저항감을 갖고 있어 치료에 어려움을 겪고 있다. 따라서 습관성있는 약이거나 수면제가 아닌 불면증 치료제를 찾으려고 연구 하던 중 본 연구진들은 산조인이 동양의학에서 오랫동안 불면증 치료에 사용되어 왔다는 동의보감(허준 1969)에 기록된 사실에 관심을 갖고 본 연구를 시작하게 되었다.
- 본 연구에서는 인간과 생체반응이 유사한 쥐를 실험대상으로 하여 실험하였으며 특히 수면물질로는 한방에서 불면증에 사용하는 산조인 중 과학적으로 수면물질로 인정된 물질인 betulinic acid와 sanjoinine-A(＝fragufoline)의 진정수면작용을 알아보 았다. 또한 혈액 내에서 수면과 세로토닌과의 관계를 알아보았으며 쥐에서의 수면뇌파를 기록하여 수면진정물질들과의 반응을 알아보았다.
- 산조인에 대한 수면 및 진정작용에 대한 연구는 betulinic acid 와 sanjoinine-A에 대한 연구를 하는 것이 산조인 생약을 직접 연구 조사하는 것보다 그 작용기능을 더 잘 알 수 있고 더 정확히 알 수 있을 것으로 생각되어 상기 두 물질에 대한 연구를 시행하였다. 생약성분의 기능을 알기는 어려운 점이 많고 특히 수면 진정작용을 알아내기는 더욱 어려운 문제점이 많다.
- 또한 혈액 내에서 수면과 세로토닌과의 관계를 알아보았으며 쥐에서의 수면뇌파를 기록하여 수면진정물질들과의 반응을 알아보았다. 한편 쥐의 뇌에서도 수용체가 인정된 lorazepam을 사용하여 혈액내의 세로토닌과 뇌파 및 산조인과의 관계도 알아보 았다. 그리고 수면작용이 아닌 진정작용의 여부를 알아보기 위해 실험물질 투여후 일정시간동안의 자발운동량을 측정하여 진정작용의 유무를 알아보았다.
제안 방법
- 3일 후 생리식염수, betulinic acid, sanjoinine-A, lorazepam을 각각 0.23ml, 3mg/kg, 3mg/kg, 0. 033mg/kg씩 투여하였으며 30분 후 thiopental sodium을 40mg/ kg 주사하였고 이후 30분 동안 뇌파 및 근전도를 측정하였다. Thiopental sodium의 용량은 저자들의 예비연구의 결과에 의해 정했으며, 안영수 등(1982)에 의하면 sanjoinine-A 및 sanjoi-nine-A1을 투여한 후 수면시간이 평균 30∼40분간 지속 된다고 보고된 바 이에 따라 뇌파 및 근전도의 측정을 30분간 시행하였다.
- 실험동물군은 4군으로 구분하였다. 1군은 생리식염수 투여군 8마리로 각각 0.23ml을 투여하고, 2군은 betulinic acid 투여군 8마리로 3mg/kg를 0.23ml의 gum arabia에 녹여 투여하고, 3군은 sanjoinine-A 투여군 8마리로 3mg/kg를 0.23ml의 생리식염수에 녹여 투여하고, 4군은 lorazepam 투여군 8마리로 0.033 mg/kg를 0.23ml의 생리식염수에 섞어 투여 하였다.
- 실험동물 각군에 해당하는 쥐 각각 2마리씩을 pentobarbital 40mg/kg로 마취한 후 머리부분 3부위와 후경부 근육의 한 부위에 전극을 고정하였다. 3일 후 생리식염수, betulinic acid, sanjoinine-A, lorazepam을 각각 0.23ml, 3mg/kg, 3mg/kg, 0. 033mg/kg씩 투여하였으며 30분 후 thiopental sodium을 40mg/ kg 주사하였고 이후 30분 동안 뇌파 및 근전도를 측정하였다.
- 033mg/kg씩 투여하였으며 30분 후 thiopental sodium을 40mg/ kg 주사하였고 이후 30분 동안 뇌파 및 근전도를 측정하였다. Thiopental sodium의 용량은 저자들의 예비연구의 결과에 의해 정했으며, 안영수 등(1982)에 의하면 sanjoinine-A 및 sanjoi-nine-A1을 투여한 후 수면시간이 평균 30∼40분간 지속 된다고 보고된 바 이에 따라 뇌파 및 근전도의 측정을 30분간 시행하였다.
- 산조인의 진정작용 및 수면작용의 효과를 알아보기 위해 산조 인의 주요 수면유발 물질로 인정되고 있는 betulinic acid와 sanjoinine-A를 쥐에 투여한 후 lorazepam과 생리식염수 군을 비교하였다. 각 군에서 수면시간 연장, 뇌파측정, EMG 측정, 혈중 세로토닌 level 측정, 자발운동측정을 시행한 바 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 투여방법은 복강내주사를 하였으며. 각 물질을 복강내주사하고 나서 30분후 주위 자극이 없는 상태에서 thiopental sodium을 40mg/kg를 복강내 주사하였으며 수면시간은 정좌반사(righting reflex)가 소실되는 시점부터 회복되는 시점까지를 기준하였다.
- 요즘 수면연구는 polysomnogram으로 많은 연구가 진행되고 있다. 그래서 각군의 실험동물 2마리씩에게 전극을 두피 3곳에 고정시키고 후정부의 근육에 한개의 전극을 고정시켜 실험물질을 투여후 뇌파를 측정하고 또 30분후 thiopental sodium을 주사하여 뇌파를 측정하였다. 이 결과 모든 군에서 β-wave가 많이 나타났고 또한 쥐가 자주 움직여 잡파가 많이 나타났다.
- 한편 쥐의 뇌에서도 수용체가 인정된 lorazepam을 사용하여 혈액내의 세로토닌과 뇌파 및 산조인과의 관계도 알아보 았다. 그리고 수면작용이 아닌 진정작용의 여부를 알아보기 위해 실험물질 투여후 일정시간동안의 자발운동량을 측정하여 진정작용의 유무를 알아보았다.
- 한편 쥐나 소에서 benzodiazepine receptor가 존재한다는 것이 입증되었는데 lorazepam이 이 수용체에 작용하여 진정수면작용을 일으킨다고 한다(井上 1991). 따라서 상기 산조인의 진정 수면 작용과 lorazepam의 진정수면 작용을 비교하기 위하여 lorazepam을 0.033mg/kg투여하여 같이 비교하였다.
- 본 연구에서는 인간과 생체반응이 유사한 쥐를 실험대상으로 하여 실험하였으며 특히 수면물질로는 한방에서 불면증에 사용하는 산조인 중 과학적으로 수면물질로 인정된 물질인 betulinic acid와 sanjoinine-A(＝fragufoline)의 진정수면작용을 알아보 았다. 또한 혈액 내에서 수면과 세로토닌과의 관계를 알아보았으며 쥐에서의 수면뇌파를 기록하여 수면진정물질들과의 반응을 알아보았다. 한편 쥐의 뇌에서도 수용체가 인정된 lorazepam을 사용하여 혈액내의 세로토닌과 뇌파 및 산조인과의 관계도 알아보 았다.
- 마지막 실험에서 실험동물들의 진정작용을 알아보기 위해 자발 운동을 측정하였다. 요즘 동물실험에서 동물들의 진정작용측정은 x-maze 방법이나 자발운동 측정방법이 사용되고 있다(박영현 1987).
- 산조인의 진정작용 및 수면작용의 효과를 알아보기 위해 산조 인의 주요 수면유발 물질로 인정되고 있는 betulinic acid와 sanjoinine-A를 쥐에 투여한 후 lorazepam과 생리식염수 군을 비교하였다. 각 군에서 수면시간 연장, 뇌파측정, EMG 측정, 혈중 세로토닌 level 측정, 자발운동측정을 시행한 바 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 실험대상군 각군마다 8마리씩에 생리식염수, betulinic acid, sanjoinine-A, lorazepam을 각각 투여하고 30분후에 자발운동측정기구를 사용하여 30분동안 자발운동량을 측정하여 진정작용유무를 알아보았다.
- 실험동물 각군에 해당하는 쥐 각각 2마리씩을 pentobarbital 40mg/kg로 마취한 후 머리부분 3부위와 후경부 근육의 한 부위에 전극을 고정하였다. 3일 후 생리식염수, betulinic acid, sanjoinine-A, lorazepam을 각각 0.
- 실험동물을 8마리씩 4군으로 나누어 실험물질을 주사후 30분에 흉부절개하여 심장에서 혈액을 2cc씩 채취하여 ependolf tube 에 담아 -70℃에 보관하였다가 서울임상병리검사센터에 보내 high performance liquid chromatography(HPLC)로 세로토닌을 측정하였다. 안영수 등(1982)과 Han과 Park(1987)의 연구에서 실험물질 주사후 30분에 마취제를 주사한후 수면시간을 측정한 방법을 참조하여 본 연구에서도 주사후 30분에 실험동물의 혈액을 채취하였다.
- 실험동물의 자발운동량 측정에는 자발운동측정상자(42×26×15cm) Natsumex(하목 제작소 Model KN70)를 이용하여 실험동물의 작은 체동을 제외한 수평방향이나 수직방향의 자발운동 (spontaneous motor activity)을 측정하였으며 약물투여 30분 후에 올려 놓고 30분 동안 측정하였다.
- 안영수 등(1982)의 연구에서 산조인 투여 30분후 thiopental sodium으로 수면유도 한 다음 정좌반사소실에서 정좌반사의 회복까지를 수면 진정작용의 기간으로 설정한 연구를 참조하여 본 연구에서도 betulinic acid 3mg/kg을 투여한 군과 sanjoinine-A 를 3mg/kg 투여한 군에 30분후 thiopental Sodium 40mg/kg 주사후 정좌반사의 반응을 조사함으로써 상기물질들의 수면 또는 진정작용을 알아보았다.
- 투여방법은 복강내주사를 하였으며. 각 물질을 복강내주사하고 나서 30분후 주위 자극이 없는 상태에서 thiopental sodium을 40mg/kg를 복강내 주사하였으며 수면시간은 정좌반사(righting reflex)가 소실되는 시점부터 회복되는 시점까지를 기준하였다.
대상 데이터
- sanjoinine-A는 Han 등(1987)이 분리한 성분으로 생리식염수에 녹여 사용하였다. lorazepam은 주사제(일동제약)를 사용하였다.
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1. 실험재료
실험동물은 체중 200∼300gm의 Spraque-Dawley 흰쥐 수컷을 사육실에서 실험 7일 전부터 물과 일정사료로 사육하여 실험 환경에 적응시켰다. 실험재료는 우선 산조인의 성분인 betulinic acid(Aldrich사, 미국)를 구입하여 5%의 gum arabia에 녹여 사용하였다.
- 실험동물은 체중 200∼300gm의 Spraque-Dawley 흰쥐 수컷을 사육실에서 실험 7일 전부터 물과 일정사료로 사육하여 실험 환경에 적응시켰다. 실험재료는 우선 산조인의 성분인 betulinic acid(Aldrich사, 미국)를 구입하여 5%의 gum arabia에 녹여 사용하였다. sanjoinine-A는 Han 등(1987)이 분리한 성분으로 생리식염수에 녹여 사용하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 얻어진 자료의 분석에는 SPSS/PC＋를 사용하였는데 각 군간의 차이를 평가하기 위해 분산분석(analysis of variance)를 이용하였다.
이론/모형
- Betulinic acid와 sanjoinine-A의 용량은 Han 등(1987)의 연구를 참고로 하였으며, lorazepam의 용량은 정신과 환자에게 사용되는 일반 용량을 쥐의 체중과 연관시켜 정하였다.
성능/효과
- 1) 수면시간 연구에서 betulinic acid군, sanjoinine-A군, lorazepam군은 생리식염수 대조군에 비해 수면시간연장을 나타내었다.
- 2) 수면뇌파측정에서 betulinic acid군, sanjoinine-A군, lorazepam군, 생리식염수군 모두에서 β-wave가 많이 나타났으며, 근전도에서의 이상소견은 발견되지 않았다.
- 3) 혈중 세로토닌의 측정에서 betulinic acid투여군, sanjoinine-A투여군에서 lorazepam투여군과 생리식염수 투여군의 비교에서 특이한 차이가 나타나지 않았다.
- 4) 자발성 운동측정실험에서 betulinic acid투여군, sanjoinineA투여군과 lorazepam투여군에서는 생리식염수 투여군에 비해 의미 있게 행동감소가 나타난 바 있으며 betulinic acid군과 sanjoinine-A투여군은 lorazepam투여군과 비슷한 결과를 나타내었다. 이는 실험물질이 실험동물들에게 진정작용이 있다고 추정된다.
- 실험결과 각군의 비교에서 betulinic acid 투여군이 생리식염수 투여군보다 수면시간이 더 길게 나타났으며(p<0.01), sanjoinine-A군과 lorazepam투여군은 생리식염수 투여군에 비해 수면 시간이 더 길게 나타났다(p<0.05). 한편 betulinic acid투여군과 sanjoinine-A투여군 및 lorazepam투여군 간에는 통계적으로 의의있는 차이가 없었다.
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2. 뇌파 및 근전도 실험
실험대상 동물에게 각 실험물질 및 thiopental sodium을 투여후 찍은 뇌파의 소견에서 생리식염수군은 전체적으로 β-wave 가 많이 나타났고 betulinic acid 및 sanjoinine-A투여군 및 lorazepam 투여군에서도 전반적으로 β-wave가 많이 나타났다 (Fig. 1, 2, 3, 4).
- 실험대상군을 생리식염수, betulinic acid, sanjoinine-A, lorazepam을 복강내 투여 30분후 thiopental sodium 40mg/kg를 복강내 주사하였고 그 후 정좌반사 소실에서 정좌반사 회복까지의 수면시간을 측정한 결과 각 군간의 유의한 차이가 있었다. Betulinic acid, sanjoinine-A로 lorazepam군이 생리식염수군에 비해 수면연장시간이 의의 있게 높았고 상기 3군간에는 차이가 없 었다.
- 실험동물각군에서의 세로토닌의 농도는 생리식염수 투여군에서는 평균 320±122ng/ml, betulinic acid 투여군에서는 평균 510±215ng/ml, sanjoinine-A 투여군에서는 평균 464±219ng/ ml, lorazepam 투여군에서는 평균 442±131ng/ml로 각 군간의 통계적인 유의한 차이는 없었다(Table 2).
- 그래서 각군의 실험동물 2마리씩에게 전극을 두피 3곳에 고정시키고 후정부의 근육에 한개의 전극을 고정시켜 실험물질을 투여후 뇌파를 측정하고 또 30분후 thiopental sodium을 주사하여 뇌파를 측정하였다. 이 결과 모든 군에서 β-wave가 많이 나타났고 또한 쥐가 자주 움직여 잡파가 많이 나타났다. Thiopental sodium 주사 후 실험동물군중 각 실험동물군에서 모두β-wave가 많이 나타났다.
- 자발운동량을 측정하여 본 결과 betulinic acid투여군은 평균 568.7±229.2로서 생리식염수 투여군(834.4±194.4)보다 자발 운동량의 감소를 보였고(p<0.05), sanjoinine-A투여군과 lorazepam투여군은 각각 평균 525.7±163.8과 438.6±209.3로서 생리식염수투여군보다 자발운동량이 감소하였다(p<0.01). 한편 betulinic acid군, sanjoinine-A군, lorazepam군들 사이에는 의의있는 차이가 없었다(Table 3).
- 측정결과 betulinic acid투여군, sanjoinine-A투여군, lorazepam투여군에서 대조군에 비해 의미 있게 자발운동량의 감소를 보였고 betulinic acid투여군과 sanjoinine-A투여군은 lorazepam투여군과 비슷한 결과를 나타내었다. 이는 betulinic acid 와 sanjoinine-A가 lorazepam과 같이 수면작용의 결과를 나타내지 못했지만 진정작용의 결과를 나타냈다고 추론할 수 있겠다.
후속연구
- 종합하면 상기물질들이 진정작용이 있다고 생각되며 세로토닌과의 관계는 연관되지 않은 것으로 해석되며 차라리 다음 연구에서는 진정작용과 관계가 깊다고 인정되고 있는 뇌신경전달물질인 GABA와 연관시켜 연구하는 것이 더 바람직하다고 생각된다. 그리고 sanjoinine-A와 betulinic acid의 투여량 및 관찰측정시간 등 방법의 보완으로서 수면작용에 대한 평가를 심도있게 추가로 연구해보는 것이 좋겠다고 생각된다.
- 종합하면 상기물질들이 진정작용이 있다고 생각되며 세로토닌과의 관계는 연관되지 않은 것으로 해석되며 차라리 다음 연구에서는 진정작용과 관계가 깊다고 인정되고 있는 뇌신경전달물질인 GABA와 연관시켜 연구하는 것이 더 바람직하다고 생각된다. 그리고 sanjoinine-A와 betulinic acid의 투여량 및 관찰측정시간 등 방법의 보완으로서 수면작용에 대한 평가를 심도있게 추가로 연구해보는 것이 좋겠다고 생각된다.
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