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문제 정의
- 이상에서 언급한 바와 같이 균근균이 수목의 생장에 관련하여 유용한 토양미생물의 역할을 지니고 있으므로， 이 연구는 우리나라에 널리 분포 되어 있는 대표적인 수종인 소나무류에 형성되는 균근균들의 배양적 특성비교와 인공접종에 의한 균근의 형성을 통하여 유용한 균근균의 선발과 아울러 소나무 생장에 있어서 균근의 역할 규명을 통한 균근형성 우량 소나무묘목의 대량생산을 위한 기초 연구로 수행되었다.
- 탄소원 및 질소원의 종류에 따른 균근균의 균사생장량을 측정하였는데 . Ln73/92와 FRI91043은 생장이 빨라 FRI91043은 7 일 후에.
제안 방법
- 30. 350 C 로 조정한 항온배양기에서 배양하면서 균사생장량을 측정하였다. pH별 균사생장량도1N HCl과 1N NaOH 를 사용하여 pH4 에서 pH9 까지 조정한 MP배지에 온도별 실험에서와 동일한 방법으로 균근균들을 접종하고 25℃ 항온기에서 배양하면서 3 일마다 측정하였으며 각 실험은 처리당 3반복으로 수행하였다.
- 균근균의 균사 생장량을 7종류의 균근균 분리및 배양배지에서 비교한 결과. Ln73/92 와 FRI91043 은 상대적으로 생장량이 빨라 접종 10일 후의 생장량을 측정하였고. Pt1은 생장이 느려 30일 후에 측정하였으며， 나머지 4균주는 20일 후의 생장량을 측정하였다.
- pH별 균사생장량의 경우. Ln73/92와 FRI91017은 6 일 후에 측정하였고 FRI91043 은 9 일 후， 나머지 균근균들은 24 일 후에 측정하였다. 특이한 것 은 Ln73/92 와 Pa60/92 는 산성 보다는 알칼리성을 선호하였고.
- 소나무류 균근균의 배양배지별 생장특성을 비교하기 위하여 일반적으로 균근균의 분리 및 배양에 많이 사용되고 있는 7종류의 배양배지에서 배양하면서 생장특성을 비교하였다 (Table 2) 각 배지는 멸균된 plastic petri dish 에 분주하여 굳힌 후에. PDA( 감자한천배지)에서 배양한 균근균을 직 경 5mm 의 cork borer로 떼 어 내 어각 배지의 중앙에 접종하고 25℃항온기에서 암상 태로 배양하면서 10일간격으로 균사생장량을 측정하였으며 각 실험은 처리당 3반복으로 수행하였다.
- Ln73/92 와 FRI91043 은 상대적으로 생장량이 빨라 접종 10일 후의 생장량을 측정하였고. Pt1은 생장이 느려 30일 후에 측정하였으며， 나머지 4균주는 20일 후의 생장량을 측정하였다. 배지별 균사 생장량은 균근균의 종류에 따라 다양하게 나타났는데 .
- 350 C 로 조정한 항온배양기에서 배양하면서 균사생장량을 측정하였다. pH별 균사생장량도1N HCl과 1N NaOH 를 사용하여 pH4 에서 pH9 까지 조정한 MP배지에 온도별 실험에서와 동일한 방법으로 균근균들을 접종하고 25℃ 항온기에서 배양하면서 3 일마다 측정하였으며 각 실험은 처리당 3반복으로 수행하였다.
- 균근 형성 을 위한 종자 소독은 Nordam과Fortin(982) 및 Brundrett 등 (996) 의 방법에 준하되， 해송 종자에 알맞도록 변형하여 실시 하였다. 해송 종자를 1 일간 흐르는 수돗물에 수세한 후.
- potassium nitrate (KN03), ammonium sulfate( (NH4)2S04) 및 asparagine을 사용하였다. 균근균을 접종한 plates는 25℃항온기에서 배양하면서 접종후 7일마다 균사생장량을 측정하였다. 직경이 5mm 인 corkborer를 사용하여 이미 배양된 균주에서 균사를 포함하는 agar disc 를 떼어내어 접종원으로 사용하였으며 각 실험은 처리당 3반복으로 수행하였다.
- 1996)의 방법에 의하여 염색한 후 현미경하에서 관찰하였다. 균근이 형성된 뿌리와 무처리한 뿌리를 수세하고 토양 및 불순물을 제거한 후에 hand section 하여 조직박편을 만들고 조직내의 색소 또는 페놀화합물 등을 제거하기 위해 10% KOH 용액에 침지하여 항온수조에서 70℃로 9 시간동안 처리하였다. 처리된 시료는 멸균수로 수세한 후， 0.
- 또한 균근이 형성된 해송의 세근과 무처리한 해송의 세근을 hand sectíon 하여 현미 경(Nomarski interference contrast microscope)하에서 관찰하였는데 . cross section의 경우 건전 해송에서는 볼 수 없었던 2가지 특정이 균근형성 세근에서 발견되었다.
- 배지별 생장량의 조사에서 얻은 결과에 기초하여 온도 및 pH 에 따른 균근균 생장량의 조사에 서는 MP배지를 사용하였다. 온도별 생장량에서도 Ln73/92 와 FRI91043 은 빠른 생장량을 보여 접종 9 일 후에 생장량을 측정하였으며 나머지 균근균들은 21 일 후에 측정하였다‘ 균근균의 균사생장량은 배양온도에 따라 많은 차이를 나타내 었는데 , 대부분의 균주들이 25℃에서 가장 잘 생장하였으며 100℃와 350℃에서는 거의 생장을 하 지 못하였다.
- 소나무류 균근균의 배양배지별 생장특성을 비교하기 위하여 일반적으로 균근균의 분리 및 배양에 많이 사용되고 있는 7종류의 배양배지에서 배양하면서 생장특성을 비교하였다 (Table 2) 각 배지는 멸균된 plastic petri dish 에 분주하여 굳힌 후에. PDA( 감자한천배지)에서 배양한 균근균을 직 경 5mm 의 cork borer로 떼 어 내 어각 배지의 중앙에 접종하고 25℃항온기에서 암상 태로 배양하면서 10일간격으로 균사생장량을 측정하였으며 각 실험은 처리당 3반복으로 수행하였다.
- 03% chlorazol black E(CBE: H20: lactic acid: glycerol = 1: 1 :1 )용액에 침지하여 항온수조에서 60℃로 3시간 처리하여 염색하였다. 염색이 끝나면 멸균수로 수세하고 50% glycerol 에 mount하여 Nomarski interference contrast microscope 하에서 관찰하였다.
- 온도별 균사생장량은 MP 배지에서 배양한 각균근균의 균사를 포함하는 agar disc 를 직 경 5mm 의 cork borer로 떼어내어 , 직경 55mm 인petri dish 에 분주하여 굳힌 MP 배 지 에 접종하였다. 접종한 균근균들은 각각 10.
- 30% H202에 20분간 처리하고 멸균수로 3회 수세하였다. 직경 90mm의 멸균된 petridÍsh 에 멸균수로 적신 cheese cloth 를 깔고 소독한 해 송종자를 1개의 plate 당 257R 씩 파종하여 25℃의 growth chamber 에 서 발아를 유도하 였으며，광암조건은 12시간씩 반복처리하였다.
- 균근균을 접종한 plates는 25℃항온기에서 배양하면서 접종후 7일마다 균사생장량을 측정하였다. 직경이 5mm 인 corkborer를 사용하여 이미 배양된 균주에서 균사를 포함하는 agar disc 를 떼어내어 접종원으로 사용하였으며 각 실험은 처리당 3반복으로 수행하였다.
- 질소원별 배지에서의 균사생장량 측정은 탄소 원별 배지에서의 균사생장량 측정과 동일한 시기에 실시하였다. 질소원별 측정에서도 FRI91043과 Ln73/92 는 질소원의 종류에 상관없이 생장이 양호하였으나 KN03.
대상 데이터
- FRI91040. FRI91043 , and FRI91004 were supplied by the Department of Forest Microbiology , Forest Research Institute , Seoul. Korea.
- urea. potassium nitrate (KN03), ammonium sulfate( (NH4)2S04) 및 asparagine을 사용하였다. 균근균을 접종한 plates는 25℃항온기에서 배양하면서 접종후 7일마다 균사생장량을 측정하였다.
- 소나무류에서 균근을 형성하는 것으로 알려진 7 종류의 균근균 균주를 국내 또는 국외로부터 분양받아 사용하였다 (Table 1)
이론/모형
- 균근균을 접종한 해송에 균근이 형성되는 지를 수시로 육안으로 확인하였으며， 육안으로 균근이 확인된 것은 Brundrett 등 0990.1996)의 방법에 의하여 염색한 후 현미경하에서 관찰하였다. 균근이 형성된 뿌리와 무처리한 뿌리를 수세하고 토양 및 불순물을 제거한 후에 hand section 하여 조직박편을 만들고 조직내의 색소 또는 페놀화합물 등을 제거하기 위해 10% KOH 용액에 침지하여 항온수조에서 70℃로 9 시간동안 처리하였다.
성능/효과
- 해송 묘목에 7종류의 균근균을 각각 접종하여 생육시킨 결과. 3개월이 지난 후에 모래밭버섯 (P t1)을 접종한 해송 묘목의 뿌리에서 균근이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 형성된 균근은 무처리한 해송뿌리와는 형태적으로 확실히 구분이 되었는데，해부현미경으로 관찰한 결과，해송의 세근이 2-3 가닥으로 짧게 분지되었고 그 부분에 두꺼운 균사막(fungal mantle) 을 형성하여 ,주근 옆에 Y자 형태로 된 균근이 다수 존재하였 으며 (Fig.
- 특이한 것 은 Ln73/92 와 Pa60/92 는 산성 보다는 알칼리성을 선호하였고. FRI91043 과 FRI91017의 경우 알칼리성에서는 생장이 둔화되었다 그러나 대부분의 균근균들이 약산성부터 약알칼리 성까지 모두 양호하게 생장하였고 모래밭버섯 균주인 FRI91004 와 Pt1 은 중성 에서 잘 생 장하였다 (Fig.3).
- 탄소원별 배지에서는 glucose와 maltose. fructose를 첨가한 배지에서 전체적으로 양호한 생장을 보였으며 기중균사도 잘 발달하여 특유의 균총색을 나타내었고，그 외의 배지에서는 균총의 크기가 작고 기중균사도 발달되지 않아 흰색 또는 투명하게 생장하였으며 xylose 를 첨가한 배지에서는 생장이 가장 불량하였다. 그러나 FRI91043 과 Ln93/92 는 모든 배지 에서 잘 생장하였다 (Fig .
- 이상의 실험 결과를 종합하면 균근균은 속 또는 종에 따라서，더구나 종내의 균주간에도 균사 생장시에 선호하는 배지의 조성，온도. plL 탕소원，질소원 등의 영양요구성에 콘 차이가 있다는 것이 확인되었으며，소나무류에서 분리된 균근균이라 할지라도 모래밭버섯중 Pt1균주만이 해송 묘목에 란근을 형성하여 균근형성은 기주와 균근 균사이에 아주 밀접한 특이성이 있는 것으로 나타났다. 앞으로의 연구는 더욱 다양한 균근균과 기주흘 사용한 균근형성의 시도와 아울러，이 실험을 통하여 균근형성이 확인된 모래밭버섯 균주 (Pt1)와 해송의 균근형성실험을 풋트와 포장실험단계로 확대하여 균끈을 형성시킨 소나무 묘목의 생장증대 및 생육상태륜 확인하고 인위적인 균근 형성에 씩한 우량소나무 묘목의 대량생산을 위한 시험이 수행되어야 할 것이다.
- FRI91017은 Hagem 배지에서 가장 잘생장하였으며，나머지는 MP 배지에서 가장 잘 생장하였다. 결과적으로 FRI91017 을 제외하고는 사용한 균근균 모두가 MP 배지에서 양호한 생장을 보이는 것으로 밝혀졌다. 따라서 이후의 모든 실험은 MP배지를 기본으로 사용하였다 (Fig.
- 배지별 생장량의 조사에서 얻은 결과에 기초하여 온도 및 pH 에 따른 균근균 생장량의 조사에 서는 MP배지를 사용하였다. 온도별 생장량에서도 Ln73/92 와 FRI91043 은 빠른 생장량을 보여 접종 9 일 후에 생장량을 측정하였으며 나머지 균근균들은 21 일 후에 측정하였다‘ 균근균의 균사생장량은 배양온도에 따라 많은 차이를 나타내 었는데 , 대부분의 균주들이 25℃에서 가장 잘 생장하였으며 100℃와 350℃에서는 거의 생장을 하 지 못하였다. 모래밭버섯 균주인 FRI91004 와 Pt1 은 30℃에서 가장 양호한 생장을 하였고 35℃에서도 잘 생장하였다 (Fig.
- 이상의 실험 결과를 종합하면 균근균은 속 또는 종에 따라서，더구나 종내의 균주간에도 균사 생장시에 선호하는 배지의 조성，온도. plL 탕소원，질소원 등의 영양요구성에 콘 차이가 있다는 것이 확인되었으며，소나무류에서 분리된 균근균이라 할지라도 모래밭버섯중 Pt1균주만이 해송 묘목에 란근을 형성하여 균근형성은 기주와 균근 균사이에 아주 밀접한 특이성이 있는 것으로 나타났다.
- cross section의 경우 건전 해송에서는 볼 수 없었던 2가지 특정이 균근형성 세근에서 발견되었다. 즉，세근의 표피세포 바깥쪽에 균근균에 의해서 두꺼운 균사층인 fungal mantle 을 형성하였고，표피세포의 사이사이(intercellular)에 균사가 침입하여 Hartig net을 형성한 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 7A). 그러나 균근이 형성되지 않은 뿌리의 세근에서는 이러한 구조적 특징을 전혀 관찰할 수 없었다.
- 3개월이 지난 후에 모래밭버섯 (P t1)을 접종한 해송 묘목의 뿌리에서 균근이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 형성된 균근은 무처리한 해송뿌리와는 형태적으로 확실히 구분이 되었는데，해부현미경으로 관찰한 결과，해송의 세근이 2-3 가닥으로 짧게 분지되었고 그 부분에 두꺼운 균사막(fungal mantle) 을 형성하여 ,주근 옆에 Y자 형태로 된 균근이 다수 존재하였 으며 (Fig.6A) . 균근이 형성된 뿌리의 바깥에는 설모양의 균근균 균사가 방사상으로 널려 있었다(Fig.
후속연구
- plL 탕소원，질소원 등의 영양요구성에 콘 차이가 있다는 것이 확인되었으며，소나무류에서 분리된 균근균이라 할지라도 모래밭버섯중 Pt1균주만이 해송 묘목에 란근을 형성하여 균근형성은 기주와 균근 균사이에 아주 밀접한 특이성이 있는 것으로 나타났다. 앞으로의 연구는 더욱 다양한 균근균과 기주흘 사용한 균근형성의 시도와 아울러，이 실험을 통하여 균근형성이 확인된 모래밭버섯 균주 (Pt1)와 해송의 균근형성실험을 풋트와 포장실험단계로 확대하여 균끈을 형성시킨 소나무 묘목의 생장증대 및 생육상태륜 확인하고 인위적인 균근 형성에 씩한 우량소나무 묘목의 대량생산을 위한 시험이 수행되어야 할 것이다.
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