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문제 정의
- 현재 미국에서는 콩류를 섭취한 사람의 뇨 흑은 혈중에 함유된 phytoestrogen의 농도를 정량하여 골다공증과의 연관성에 대한 연구를 진행하고 있다. 본 연구는 골다공증 연구의 일환으로 estrogen의 대체약이 될 수 있는 여러 식품에 함유된 phytoestrogen 의 정량에 초점을 두었으며 골다공증은 수십년에 걸쳐 나타나는 만성질환이므로 매일의 식단에서 그 예방책을 찾고자 본 연구를 시작하였다.
가설 설정
- 2)ND means no detection.
제안 방법
- 각각의 daidzein(0.051~213.71 μg/mL), genistein(0.056~194.20 μg/mL), 및 formononetin(0.025~5.00 μg /mL)을 메탄올로 여러 농도로 희석하여 내부표준물질인 aloe-emodin(4 μg/mL>을 동량 첨가하여 상등액 20μ1씩을 HPLC에 주입하여 각각의 크로마토그램을 얻었다. 표준검량 곡선은 daidzein, genistein, formononetin의 여러농도에서 이들의 피이크들의 높이를 각각 내부 표준물질의 피이크 높이에 대한 비율(peak height ratio)로 계산하여 작성하였다.
- 그래서 본 연구에서는 국내에서 소비가 많고 우리의 식생활과 매우 밀접한 관계가 있는 콩류로 강남콩, 완두콩, 약콩, 대두와 대두 가공 식품인 된장, 간장, 두부, 콩나물 등을 사용하여 isoflavone인 daidzein, genistein, formononetin 둥의 함량을 HPLC를 이용하여 정량하였다. Isoflavone 정량분석에 앞서 상품화 되지 않은 formononetin은 다른 식물(Trifolium subterraneum var.
- 5 μg/mL)의 분광 광도계 에서 흡광도가 최대인 26()nm에서 분석하였다. 내부 표준물질의 선택은 앞의 이 동상에 서 formononetin의 머무름 시간(retention time)과 꼬리끌림 (tailing)괴 실험 시료 중에 존재하는 다른 물질들의 머무름 시간이 내부 표준물질의 머무름 시간과 겹치는 것이 있는지를 고려하여 가능성이 있는 여러 가지 물질들을 선택하여 확인한 후 내부 표준물질로 aloe-emodin을 선택하여 사용하였다.
- 3 g을 각각 취하여 600μl의 이동상에 녹인 후. 내부표준물질 (4μg/mL)을 가하고 14,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 (Eppendotf model 5402, Hamburg, Germany), 그 상등액을 여과하고(0.45 μm, Minisart RC 4, Sirtorius, Gottingen, Germany) 그 여액을 위의 HPLC 조건에서 분석하였다. 또한 각 시료의 메탄올 건조 산사 0.
- 행하였다. 대부분의 phytoestrogen 및 그 배당체들은 70% 메탄올에 추출된다는 보고도 있으나 천연물에 함유된 성분들을 전량 추출하여 정량하는 것은 상당한 어려움이 있으므로 대두 및 가공식품의 각각에 최소한 3-6개의 시료를 추출하고 가능한 오차를 줄이기 위해 각 추출물을 3-4회씩 분석하여 평균값을 구하였다(Table 1, Table 2). 정량분석을 위해 HPLC의 각 피이크의 높이는 valley to valley를 피이크의 바탕선으로 하여 계산하였다.
- 이 건조 잔사에 600μL의 이동상을 가하여 녹인 후 위의 유리 isoflavone의 함량분석법과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 행하였으며 이 isoflavone 함량을 총량으로 나타내었다. 동시에 표준품 isoflavone으로 이들의 추출 회수율을 계산하여 보정하였다.
- 두부, 대두, 강남콩, 약콩. 된장, 메주를 냉동 건조한 후 각각 50 g씩 취하여 500 mL 각각 70% 메탄올 용액에 2일 동안 상온에서 교반하면서 1회 추출하고 추출물을 건조하였다. 그러나 간장은 50mL를 건조시킨 후 위와 동일한 방법으로 추출하였고 콩기름은 0.
- 27분이었다. 또한 각 시료에 함유된 isoflavone들의 HPLC 피이크의 확인은 표준품을 이용하여 확인하였다. 이들의 표준검량 곡선은 Fig.
- 2). 또한 전기화학 검출기를 사용하여 정량분석을 시도하였으나 다른 보고(12)에서 발표한 내용과는 달리 formononetin의 경우에 glassy carbon을 작업전극으로 하여 1.2 V 이상에서 검출하여야 하며 바탕선이 안정되지 않았기에 UV/VIS검출기 만을 사용하여 분석하였다.
- 3 g을을 취하고 1 M HC1 2mL를 첨가하여 100℃에서 2시간 동안 가수분해한 후 40℃에서 질소가스로 건조시켰다. 이 건조 잔사에 600μL의 이동상을 가하여 녹인 후 위의 유리 isoflavone의 함량분석법과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 행하였으며 이 isoflavone 함량을 총량으로 나타내었다. 동시에 표준품 isoflavone으로 이들의 추출 회수율을 계산하여 보정하였다.
- 60 mm)을 사용하였다. 이동상은 여러 연구자들의 연구보고(11,12,13,14)를 참조하여 이동상의 조건을 변형하고 분리도가 가장 좋은 5mM NaH2PO4용액 (pH 4.6)과 메탄올의 혼합액 (4:6)을을 사용하였고, 유속은 ImL/nin로 정하였고 formononetin(0.5 μg/mL)의 분광 광도계 에서 흡광도가 최대인 26()nm에서 분석하였다. 내부 표준물질의 선택은 앞의 이 동상에 서 formononetin의 머무름 시간(retention time)과 꼬리끌림 (tailing)괴 실험 시료 중에 존재하는 다른 물질들의 머무름 시간이 내부 표준물질의 머무름 시간과 겹치는 것이 있는지를 고려하여 가능성이 있는 여러 가지 물질들을 선택하여 확인한 후 내부 표준물질로 aloe-emodin을 선택하여 사용하였다.
- 대부분의 phytoestrogen 및 그 배당체들은 70% 메탄올에 추출된다는 보고도 있으나 천연물에 함유된 성분들을 전량 추출하여 정량하는 것은 상당한 어려움이 있으므로 대두 및 가공식품의 각각에 최소한 3-6개의 시료를 추출하고 가능한 오차를 줄이기 위해 각 추출물을 3-4회씩 분석하여 평균값을 구하였다(Table 1, Table 2). 정량분석을 위해 HPLC의 각 피이크의 높이는 valley to valley를 피이크의 바탕선으로 하여 계산하였다. 이 방법은 인접한 피이크의 영향으로 면적비율은 상대적으로 오차가 크지만 높이 비율은 오차가 작기 때문에 피이크의 높이비율로 검량곡선을 작성하였다.
- 00 μg /mL)을 메탄올로 여러 농도로 희석하여 내부표준물질인 aloe-emodin(4 μg/mL>을 동량 첨가하여 상등액 20μ1씩을 HPLC에 주입하여 각각의 크로마토그램을 얻었다. 표준검량 곡선은 daidzein, genistein, formononetin의 여러농도에서 이들의 피이크들의 높이를 각각 내부 표준물질의 피이크 높이에 대한 비율(peak height ratio)로 계산하여 작성하였다. 이들에 대한 검량곡선식 및 상관계수는 Sigmaplot@ 프로그램 (Jandel Scientific.
- 현재까지 알려진 isoflavone 중의 phytoestrogen은 daidzein, genistein, biochanin A, formononetin, coumestr이 등이 있으며 isoflavone류가 배당체로 많이 존재한다는 보고도 있으므로(2,6,11), 본 연구에서는 70% 메탄올 추출액에서 먼저 유리상태의 isoflavone류를 정량하고 phytoestrogen을 추출한 시료를 가수분해하여 유리형이나 배당체와 결합한 결합형의 총량에 대한 정량분석을 행하였다. 대부분의 phytoestrogen 및 그 배당체들은 70% 메탄올에 추출된다는 보고도 있으나 천연물에 함유된 성분들을 전량 추출하여 정량하는 것은 상당한 어려움이 있으므로 대두 및 가공식품의 각각에 최소한 3-6개의 시료를 추출하고 가능한 오차를 줄이기 위해 각 추출물을 3-4회씩 분석하여 평균값을 구하였다(Table 1, Table 2).
대상 데이터
- HPLC용 용매로 메탄올은 Merck Co.(Darmstadt, Germany)의 제품을 사용하였고, 기타 추출과 정제할 때 사용한 용매인 에탄올, 메탄올 등은 일등급을 증류하여 사용하였으며 그 외의 시약들은 시약용 시약들을 사용하였다.
- Dwalganup 등)에도 많이 존재하고 있으나(2,4) 대두 와 같은 콩과 식물에 속하는 한약재로 가장 흔히 사용되고, 대한약전(16)에 formononetin이 지표물질로 검토되고 있는 황기membranaceus Bunge.: Astragali Radix)에서 분리 정제하여 사용하였다.
- 또 메주, 완두콩, 강남콩, 대두. 약콩 등은 국내산으로 시장에서 구입하여 사용하였다.
- 또한 일본식 두부와 일본식 된장 등에서는 formononetin의 존재가 확인되지 않았고 다만 daidzein이나 genistein의 존재만 확인 정량되었다. 이로써 본 연구에서는 특히 formononetin의 정량을 위해 이미 보고한 바와 같이 formononetin을 황기에서 추출, 분리, 정제, 확인하여 표준품으로 사용하였다(15). 황기는 Table 2에서와 같이 formononetin0) 다른 제품보다도 대량으로 존재하고 daidzein이나 genisteirv은 검출한계 이하였다: 특이한 사항은 전통식품인 메주, 된장, 콩나물에 함유된 phytoestrogen의 함량이 높았고 약콩의 formononetin 함량이 다른 콩에 비해 높았다.
- 이소플라본의 정량 분석에 사용된 HPLC는 spectra system P1000 (Thermo Separation Products, Fremont, CA, U.S.A.)를 사용하였고, Column은 Phenomenex Co. (Torroance, CA, U.S.A.)의 Spherex5 C18 (250×4.60mm; 5μ)와 prodigy 5μ ODS (30×4.60 mm)을 사용하였다. 이동상은 여러 연구자들의 연구보고(11,12,13,14)를 참조하여 이동상의 조건을 변형하고 분리도가 가장 좋은 5mM NaH2PO4용액 (pH 4.
- : Astragali Radix)는 강원도 정선군에서 재배된 것을 사용하였고(표본번호 KIOM 96-3-0001). 콩나물은 찬마루식품(충북 음성군), 두부는 찬마루 식품(충북 괴산), 콩기름은 신동방(주)(인천시 서구), 간장은 귀빈식품(전남 해남), 된장은 명가식품(충북 괴산)에서 1998년도에 제조한 것을 사용하였다. 또 메주, 완두콩, 강남콩, 대두.
- 나타난 바와 같다. 특히 간장은 소금의 함량이 상당히 높아서 추출에 어려움이 있었기에 100% 메탄올로 추출하여 사용하였다.
- 표순물질로는 aloe-emodin, genistein, daidzein(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, U.S.A)을 사용하였으며, formononetin은 본 연구팀이 황기에서 추출 정제하여 NMR, MS로 확인한 후에 사용하였다(15). HPLC용 용매로 메탄올은 Merck Co.
- 황기(Astragalus membranaceus Bunge.: Astragali Radix)는 강원도 정선군에서 재배된 것을 사용하였고(표본번호 KIOM 96-3-0001). 콩나물은 찬마루식품(충북 음성군), 두부는 찬마루 식품(충북 괴산), 콩기름은 신동방(주)(인천시 서구), 간장은 귀빈식품(전남 해남), 된장은 명가식품(충북 괴산)에서 1998년도에 제조한 것을 사용하였다.
데이터처리
- 표준검량 곡선은 daidzein, genistein, formononetin의 여러농도에서 이들의 피이크들의 높이를 각각 내부 표준물질의 피이크 높이에 대한 비율(peak height ratio)로 계산하여 작성하였다. 이들에 대한 검량곡선식 및 상관계수는 Sigmaplot@ 프로그램 (Jandel Scientific. Chicago, IL, USA.)에 의하여 작성하였다.
성능/효과
- 이외에 radio immunology를 이용한 방법도 있었다(17). 그러나 본 연구의 예비실험을 분석한 결과 UV/VIS검출기로 정량한 방법도 상당히 안정된 연구결과를 나타내었으며 formononetin의 정량은 25 ng/mL까지 가능하였다(Fig. 1 및 Fig. 2). 또한 전기화학 검출기를 사용하여 정량분석을 시도하였으나 다른 보고(12)에서 발표한 내용과는 달리 formononetin의 경우에 glassy carbon을 작업전극으로 하여 1.
- 05). 그러나 유리 formononetin의 함량은 daidzein, genisteir과는 다른 양상을 보였고, 콩나물(334.90±26.14 μg/kgA formono-netin의 함량은 대두(60.62±11.35 μg/kg)에 비해 높았고(P<0.01), 약콩은 45.20±5.42μg/kg이었으나 콩기름에서는 formononetin이 검출되지 않았다. 70% 메탄올 추출물을 가수분해하였을 때, isoflavone의 총 함량 중에서 genistein은 많은 경우에 유리된 형태로 존재하나 daidzein과 formononetin은 배당체등이 결합한 화합물의 형태로 많이 존재하였다(Table 2).
- 또한 Franke둥(6)은 강남콩과 완두콩의 isoflavone을 정량할 수 없었으며 본 연구에서도 검출한계 이하로 정량할 수 없었다. 그러므로 콩기름, 완두콩, 강남콩 등은 formononetin이 검출되지 않았고, 전통식품인 두부, 콩나물, 간장, 된장, 메주에는 formononetin을 비롯한 많은 phytoestrogen이 함유되어 있으며, 황기와 같은 한약재를 포함하여 이들 전통식품을 응용하여 폐경기에 나타나는 퇴행성 질환인 골다공증의 예방 및 치료에 기여할 수 있다고 사료된다.
- Dwalganup 등 일부 식물에 더 많이 함유된 것으로 알려졌다. 또한 일본식 두부와 일본식 된장 등에서는 formononetin의 존재가 확인되지 않았고 다만 daidzein이나 genistein의 존재만 확인 정량되었다. 이로써 본 연구에서는 특히 formononetin의 정량을 위해 이미 보고한 바와 같이 formononetin을 황기에서 추출, 분리, 정제, 확인하여 표준품으로 사용하였다(15).
- 시료들 중에서 된장, 두부 및 콩나물의 냉동 건조 후, 건조량은 총량의 각각 41.85±0.20%, 17.28 ±0.03%, 및 11.25±1.57% 이었다. 또한 간장은 50 mL를 건조하여 건조잔사 19.
후속연구
- 황기는 Table 2에서와 같이 formononetin0) 다른 제품보다도 대량으로 존재하고 daidzein이나 genisteirv은 검출한계 이하였다: 특이한 사항은 전통식품인 메주, 된장, 콩나물에 함유된 phytoestrogen의 함량이 높았고 약콩의 formononetin 함량이 다른 콩에 비해 높았다. 또한 우리의 전통식품에 함유된 유리형 phytoestrogen의 함량이 높았는데, 이는 발효과정에서 배당체로 존재하던 isoflavone이 유리형으로 나타난 것인지 아니면 다른 전구물질에서 대사 또는 분해되어 함량이 높아진 것인지에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
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